益气解毒复方对重症肌无力患者中医证候影响及Th17/Treg细胞免疫调节作用*

刘亚林，吴远华，郭青，蔡友德，王珊珊，李衬，何前松**

（1.贵州中医药大学第一临床医学院 贵阳 550025；2.织金县中医医院 毕节 552100；3.贵州医科大学附属金阳医院 贵阳 550018）

重症肌无力（Myasthenia gravis，MG）是由自身抗体介导的获得性神经-肌肉接头传递障碍的自身免疫性疾病，以自发性肌无力和肌疲劳为主要临床表现[1]。MG的治疗是世界性的难题，主要以控制症状和预防急性加重为临床治疗目标[2]。近年来，多项研究报道，维持Treg/Th17细胞免疫平衡在MG的治疗中显得尤为重要[3-4]，根据中医辨证论治，中药多成分、多中心、多靶点的作用特点，使得中医药对Th17/Treg细胞的免疫调节是免疫介导炎症性疾病治疗的新途径[5]，且诸多国内医家运用中医药治疗MG已取得了一定的效果[6-7]。

益气解毒复方（原补脾强力复方）由贵州中医药大学第二附属医院况时祥教授在总结前人理论基础上，结合长期临床观察而创立。该方以“虚、毒、结、损”为MG病机特点，以“补脾益肾、扶阳益损、解毒散结”为治疗原则[8]，临床疗效显著。根据文献研究，益气解毒复方可调节MG患者外周血中T淋巴细胞亚群的比例，进而调节机体的免疫力，达到治疗MG的效果，显著性提高临床总有效率[9]。而常规西医治疗联合益气解毒复方，治疗MG疗效显著，可协同增效，其机制可能与上调血清Tfr/Tfh细胞比值及减少白细胞介素-21（Interleukin-21，IL-21）及抗乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）水平有关[10]。

有研究报道，在MG患者CD4+T细胞中，Th17细胞比例及其相关细胞因子表达量显著增加，而Treg细胞比例及其相关细胞因子表达量显著降低[11]。为进一步明确益气解毒复方对MG患者T淋巴细胞Th17/Treg细胞及细胞因子表达的影响，观察了该方对MG患者外周血中Th17、Treg细胞百分比及外周血中叉头框蛋白p3（Foxp3）、视黄酸受体相关孤儿受体-γt（RORγt）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）等表达水平的影响，以期为临床运用益气解毒复方治疗MG提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机将63例重症肌无力患者分为对照组（n=31）和治疗组（n=32）。对照组中有男性患者11例，女性患者20例，年龄20-70岁，平均为42.45岁，病程的中位数和四分位数间距为3.0（1.0，5.0）年。治疗组患者中有男性8例，女性24例，年龄20-70岁，平均为40.38岁，病程的中位数和四分位数间距为2.0（1.0，6.8）年，组间无统计学差异（P＞0.05)。

1.2 纳入标准

①符合MG诊断标准[12-13]。②符合美国重症肌无力基金会（Myasthenia gravis foundation of America，MGFA）临床分型中Ⅰ、IIa及IIb型者。③性别不限，18-70岁之间。④中医证候可见主症：眼睑下垂、肢体乏力、复视；次症：头晕目眩，纳差、便溏；面色少华；少气懒言；肢体困重；目睛转动不灵。舌诊：舌质淡、胖大或舌边有齿痕；苔薄白或白腻。脉诊：脉弱细或缓弱或脉濡或脉滑。患者具有主症中任何一项+舌脉诊中任何一项，或主症+兼次症+舌脉诊中任何一项。⑤已签署知情同意书。

1.3 排除标准

①不符合纳入标准者；②合并严重肝肾功能不全、心脑血管疾病等患者；③对治疗过程中出现药物过敏者。

1.4 脱落标准

①患者未根据实验设定的治疗方案或自行改变原计划治疗方法；②在治疗期间出现肌无力危象者，如眼肌型患者分型转化且恶化，或病情加重，出现吞咽、咳痰及呼吸费劲，或明显的气促、气喘表现，可伴随发绀、意识障碍、呼吸衰竭。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组治疗方案

根据课题组前期研究[10]，给药溴吡斯的明片（上海中西三维药业有限公司，国药准字H31020867）60 mg/次，3-4次/日，症状好转后可逐渐减量至停药。Ⅰ型：单纯眼肌型，运用醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33021007）0.5-1.0 mg·kg-1口服，每日1次，晨起顿服，疗程6-8周，病情稳定后逐渐减量。Ⅱa型：轻度全身型，口服胆碱酯酶抑制剂加中等剂量糖皮质激素，起始用甲泼尼龙琥珀酸钠（40 mg/瓶，Pfizer Manufacturing Belgium NV，国药准字号：H20130301，注射用）120-80 mg·d-1，静脉注射3-5天，减量至80-60 mg·d-1，然后改为口服，口服方法同Ⅰ型。Ⅱb型：中度全身型及以上或顽固性眼肌型，口服胆碱酯酶抑制剂加用短程大剂量激素，甲泼尼龙琥珀酸钠（500 mg/瓶，Pfizer Manufacturing Belgium NV，国药准字号：H20130303）500-1000 mg·d-1静脉注射3-5天，依次减量为500 mg·d-1（使用1000 mg冲击者）、250 mg·d-1、120 mg·d-1，分别静脉注射3-5天后，改为口服，口服方法同上。服用激素期间，常规口服补钙、补钾药物预防电解质紊乱，泮托拉唑等预防激素副作用。

1.5.2 治疗组（益气解毒复方）治疗方案

在对照组的基础上加服益气解毒复方丸剂，每次1丸，早晚服用，疗程为12周。益气解毒复方丸剂由黄芪、土茯苓、人参、仙灵脾、生地黄、漏芦、白芥子等组成，经贵州中医药大学第二附属医院中药房制成丸剂，制作过程遵循无菌原则，严格无污染，制作完成后密封存放于4℃冰箱，标记后分发给受试者。

1.6 标本的采集与存放

分别抽取入组MG患者治疗前、后外周静脉血两管，其中肝素抗凝管用于流式细胞分析和反转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）的检测，并于抽取后24 h内进行检测；生化促凝管用于细胞因子及抗体检测，抽取后离心取上清液，于-20℃冰箱保存备用，采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）进行检测。

1.7 观察指标

1.7.1 中医证候积分

用中医证候量表评估患者中医证候积分，包括：眼睑下垂、眼球运动障碍、视歧、脘腹胀满、肢体困重、食少纳呆、便溏、便秘、腰膝酸软及口干口苦等10个项目，每项0-3分，满分30分，分值与病情成正相关。评分细则如下：0分=无；1分=偶有发生，症状较轻，休息可缓解；2分=经常发生，症状较重，休息后可缓解；3分=持续存在，影响正常工作生活。

1.7.2 临床疗效评定

参照胡国恒等[14]的制定的疗效评定方法评分，治疗前判定值（X）＝（疗前分值-疗后分值）/疗前分值×100%。痊愈：X＞3/4；显效:3/4＞X＞3/5；有效:3/5＞X＞1/3；无效:X＜1/3。总有效率=（总例数-无效例数）/总例数×100%。

1.7.3 流式细胞术检测外周血中Th17、Treg细胞比例

根据流式细胞仪应用淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的前向散射光（Forward scatter，FS）和侧向散射光（Side scatter，SS）不同特征，分离分析淋巴细胞的原理[15-16]，检测外周血中Th17、Treg细胞比例。分别抽取入组MG患者治疗前、后外周静脉血进行检测分析。主要胞内抗体IL17A-PE、Foxp3-PE以及膜抗体CD3-APC、CD8-PerCPCY5.5、CD4-FITC、CD25-APC均购于美国BD公司（Becton，Dickinson and Company，USA）。按说明书配制红细胞裂解液，Foxp3破膜剂与Foxp3破膜剂洗涤液；参考文献操作步骤[16]，制备上机待测液；根据LSR Fortessa流式细胞仪操作规程，上样检测分析。

1.7.4 RT-PCR技术检测血液中Foxp3、RORγt基因表达量

根据RT-PCR技术原理[17-18]，采用实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号：CFX96）进行RT-PCR分析。根据TaKaRa试剂盒说明书提取总RNA，并将其逆转录为cDNA，产物进行PCR扩增，扩增条件及引物设计参考文献[19]。结束后计算各样本测定基因的循环阈值（Cycle threshold，Ct）与内对照β-action基因差值Δ Ct，根据ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt，结果以2-ΔΔCt表示mRNA相对表达量。

1.7.5 ELISA法检测外周血中IL-6、IL-17表达水平

根据酶联免疫吸附检测法（ELISA法）的应用特点[20-21]，采用酶标仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：Multiskan™ FC），参照人IL-6试剂盒（Abcam，批号：ab178013）、IL-17试剂盒（Abcam，批号：ab119535）说明，分别检测治疗前和治疗后外周血中IL-6、IL-17的表达水平。

1.8 统计方法

所有数据均使用SPSS 26.0 （Statistical Product Service Solutions）软件进行统计分析，计量资料用均值±标准差（±s）表示，符合正态分布，用独立样本T检验，治疗前后用配对T检验；不符合正态分布，用非参数检验。计数资料用例（率）表示，用χ2检验。方差齐性，组间比较用单因素方差分析。结果 以P＜0.05，差异具有显著性；P＜0.01，差异具有极显著性。

2 结果

2.1 中医证候积分比较

治疗前，对照组和治疗组患者的中医证候积分差异不明显（P＞0.05）；与治疗前比较，治疗后两组患者的中医证候积分明显降低，差异具有显著性（P＜0.05）；治疗后，与对照组相比，治疗组患者的中医证候积分明显降低，差异具有显著性（P＜0.05），表明益气解毒复方能有效改善MG症状。结果 见表1。

表1 两组患者治疗前后中医症积分比较M（P25, P75）

2.2 中医疗效比较

治疗组临床总有效率高于对照组，差异显著（P＜0.05），表明益气解毒复方可明显提高MG临床疗效。结果 见表2。

表2 治疗组和对照组的中医临床疗效比较[例(%)]

2.3 Th17/Treg细胞的百分比变化比较

治疗前，两组患者外周血中Th17/Treg细胞的百分比相比无显著差异（P＞0.05）；治疗后，两组患者外周血中Th17/Treg细胞的百分比相比差异显著，治疗组（益气解毒复方）可显著升高Treg细胞的百分比、降低Th17细胞的百分比（P＜0.05)，表明益气解毒复方可能通过调节Th17/Treg细胞的百分比而改善MG症状。结果 见表3。

表3 两组患者治疗前后外周血中Th17/Treg百分比比较（±s）

表3 两组患者治疗前后外周血中Th17/Treg百分比比较（±s）

注：与治疗后对照组相比，##P＜0.01。

组别对照组治疗组（益气解毒复方）n 31 32时间治疗前治疗后治疗前治疗后Th17 5.04±1.52 3.03±0.67 4.57±1.56 1.97±0.49##Treg 4.60±1.33 4.60±1.19 4.45±0.86 7.55±1.26##

2.4 Foxp3和RORγt基因表达量比较

治疗前，两组患者治疗前后外周血中Foxp3和RORγt基因表达相比无显著差异（P＞0.05）；治疗后，两组患者治疗前后外周血中Foxp3和RORγt基因表达相比差异显著，与对照组比较，治疗组Foxp3基因表达量显著升高，RORγt基因表达量显著降低（P＜0.05），表明益气解毒复方可能通过升高Foxp3基因，下调RORγt基因水平改善MG症状。结果 见表4。

表4 两组患者治疗前后外周血中RORγt和Foxp3基因表达量比较（±s）

表4 两组患者治疗前后外周血中RORγt和Foxp3基因表达量比较（±s）

注：与治疗后对照组相比，##P＜0.01。

组别对照组治疗组（益气解毒复方）n 31 32时间治疗前治疗后治疗前治疗后RORγt mRNA 2.84±0.54 2.53±0.45 3.01±0.74 1.99±0.43##Foxp3 mRNA 2.40±0.70 3.80±1.03 2.30±0.56 4.50±0.76##

2.5 IL-6、IL-17细胞因子表达水平比较

治疗前，两组患者外周血中IL-6、IL-17细胞因子表达水平相比无显著差异（P＞0.05）；治疗后，与对照组比较，治疗组患者外周血中IL-6、IL-17细胞因子表达水平显著降低（P＜0.05），表明益气解毒复方可能通过下调IL-6、IL-17细胞因子表达水平改善MG症状。结果 见表5。

表5 两组患者治疗前后外周血中IL-6、IL-17细胞因子表达水平比较（±s）

表5 两组患者治疗前后外周血中IL-6、IL-17细胞因子表达水平比较（±s）

注：与治疗后对照组相比，##P＜0.01。

组别对照组治疗组（益气解毒复方）n 31 32时间治疗前治疗后治疗前治疗后IL-6 21.40±1.58 7.20±1.21 22.14±1.43 4.70±0.84##IL-17 18.05±4.01 9.25±2.11 18.35±3.96 7.83±1.97##

3 讨论

重症肌无力（MG）属于中医学之“痿病”、“睑废”等范畴。历代医家多从五脏虚损的角度论治MG，取得了一定疗效[7,22-24]。课题组前期研究认为MG的发病与“毒邪”有关，运用益气解毒复方治疗MG临床疗效较好，且可减轻激素的依赖性[8,25]。同时，研究证实益气解毒复方可明显促进MG患者胸腺髓质上皮细胞（mTEC）和调节性T细胞（Treg）的增殖[26]。本研究结果显示，运用益气解毒复方治疗12周后，与对照组比较，可改善MG患者的临床症状，显著降低MG患者的中医证候积分（P＜0.05），提高临床总有效率（P＜0.05），但其作用机制尚不清楚。

MG的发病机制十分复杂，涉及到免疫调控细胞、效应T细胞、B细胞、补体及自身免疫性抗体等多个环节。已有研究显示，Th17/Treg免疫平衡在MG的病理进程中起着至关重要的作用[27]，二者具有共同的来源CD4+T细胞，在维持着机体免疫功能方面具有拮抗作用[28]。就MG的发生发展而言，Th17则可促进MG的发展，而Treg则可抑制MG的发展，两者相互拮抗[29]。研究表明，Th17细胞分泌的IL-17可促使B淋巴细胞产生致病性的AChR-Ab参与MG的病理过程[30]；而IL-17不仅能抑制Treg的分化，还能反过来促进Th17的分化，形成恶性循环推动病情进展[31]。研究发现，RORγt与Foxp3分别是驱动Th17和Treg细胞分化所必需的转录因子[32]；有研究显示，通过上调Foxp3的转录和表达可增强自身免疫抑制，调控淋巴细胞因子使其恢复免疫平衡稳态，达到治疗MG的效果[33]；RORγt可诱导Th17细胞的分化，促使炎症因子的释放介导自身免疫性炎症的发生[34]。RORγt与Foxp3的数量或性质改变可导致Th17/Treg失衡导致MG的发生。此外，有研究报道，细胞因子IL-6在协调Th17细胞的分化方面扮演者重要的角色[32]，可通过激活RORγt的表达，促使CD4+T淋巴细胞分化为Th17细胞[4]。而本研究结果显示，联合益气解毒复方治疗后，与对照组相比，治疗组可显著降低外周血中细胞因子IL-6、IL-17和RORγt基因的表达水平，以及降低Th17细胞百分比（P＜0.05），显著升高外周血中Foxp3基因的表达及Treg细胞百分比（P＜0.05）。

综上所述，在常规西药的基础上，联合益气解毒复方能明显改善MG患者的临床症状，降低MG患者的中医证候积分，其作用机制可能通过调节外周血中细胞因子IL-6与转录因子RORγt、Foxp3的表达，进而影响Th17、Treg的分化，减少炎性因子IL-17的释放，减轻免疫炎症效应，以达到调节外周血中Th17/Treg细胞间的平衡作用。因此，本研究治疗方案为中西医结合治疗MG，加服益气解毒复方能起到协同增效作用，具有较好的治疗前景。由于复方中药具有多成分、多中心、多靶点的作用特点，为了进一步论证该复方对MG患者的改善作用，明确药效物质基础，阐明作用机制，后期研究将增加复方纯中药治疗组，以期为该复方制剂的研究开发和应用推广奠定良好的实验基础。