中药活性成分干预脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的研究进展

谢 娟，李玉玲，梁 慧，谭庆晶，吴 鹏*

（1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是缺血性脑卒中血流供应恢复后出现的神经细胞结构和功能进一步损伤的病理过程［1］。目前阻断脑卒中向CIRI 进展的治疗主要以对症处理为主［2］，寻找阻断或治疗CIRI的有效药物是临床上亟待解决的问题［3］。中医学无“脑缺血再灌注损伤”的病名，按照CIRI 临床症候表现，认为其属于缺血性中风的范畴，证属本虚标实［4］。急性期以风火、痰热、血瘀等实证为主，多治以平肝潜阳、化痰息风、清热通腑和活血化瘀；恢复期、后遗症期则以气阴两伤、脾肾亏虚等虚证为主，常治以益气滋阴、补益脾肾之法［5］。目前，兴奋性氨基酸毒性作用、自由基堆积、免疫功能失调、细胞内钙超载与细胞凋亡等被认为是CIRI发生的重要机制［6］。研究发现众多中药活性成分能够通过抑制神经细胞凋亡拮抗CIRI，故本文就目前该领域的研究进行系统回顾及总结，以期为该领域的研究人员提供一定的研究思路和方向。

1 脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的发生机制

细胞凋亡是目前研究较深入的一种程序性细胞死亡方式，对保持正常机体功能具有重要作用［7］。若机体细胞凋亡机制长时间异常，将导致继发性坏死和加重免疫应激［8］。近期研究表明，脑缺血组织恢复再灌注期间的神经细胞过度凋亡可进一步加剧CIRI 的程度。通过检索相关文献发现，学者们普遍认为细胞凋亡主要由线粒体损伤、外源性死亡受体、内质网应激、兴奋性氨基酸（EAA）/氧自由基、钙超载、炎症反应等引起。

1.1 线粒体损伤 外源性刺激会导致线粒体外膜电位下降，促使细胞色素C（Cyto-C）从线粒体移位至细胞质，随后与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）作用，并促进其寡聚化，使天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-9被活化，随即激活Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，共同促进细胞凋亡［9-10］。该过程的启动受B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）家族蛋白调节［11］，可分为促凋亡蛋白［细胞内Bcl-2 基因相关启动子（Bad）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、Bcl-2 拮抗/杀伤因子（Bak）、人BH3 结构域凋亡诱导蛋白（Bid）和细胞死亡的Bcl-2 相互作用介质（Bim）］和抗凋亡蛋白［Bcl-2、额外B淋巴细胞瘤（Bcl-x）、大分子B淋巴细胞瘤（Bcl-xl）和Bcl-2相关的血管生成素（Bag）］［12-13］，二者共同调控细胞凋亡。

1.2 外源性死亡受体 该途径主要通过调控死亡因子（FasL）与死亡受体（Fas）、肿瘤坏死因子（TNF）、肿瘤坏死因子受体（TNFR）、肿瘤坏死因子相关凋亡配体（TRAIL）、凋亡诱导受体（DR）4 和DR5 来介导细胞凋亡［14］。受体通过Fas 相关死亡域蛋白（FADD）或TNFR1 相关死亡结构域蛋白（TRADD），与Caspase-8前体组成死亡诱导信号复合物（DISC），Caspase-8 前体在复合物中被激活，进而可促使Caspase-3 活化，导致细胞死亡［15］。

1.3 内质网应激 当机体由于各种因素发生内质网应激时，会通过未折叠蛋白质反应来应对内质网应激［16］，该反应主要由肌醇需求酶1（IRE1）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）和激活转录因子6（ATF6）三者激活。IRE1 与TNF 受体相关因子2（TRAF2）结合后，会导致氨基末端激酶（JNK）被激活，活化后的JNK会促进Bad 表达，从而诱导细胞凋亡［17］。PERK 则通过促进真核翻译起始因子（eIF2α）和激活转录因子4（ATF4）的转录翻译而发挥作用。在持续性和高强度的内质网应激下，翻译后的ATF4 会诱导内质网应激蛋白（CHOP）的生成［18］，随后上调Bax 和Bak 蛋白的含量，诱导细胞凋亡。

1.4 兴奋性氨基酸/氧自由基 EAA 是一种常见的神经递质，主要在神经元和胶质细胞中过度表达，包括谷氨酸、天冬氨酸等，可显著影响神经细胞的凋亡［19］。谷氨酸可以引发快速的信号转导，参与机体学习、记忆以及突触可塑性调节，当其表达增加可导致神经元钙平衡的调节不良，进一步导致氧化应激、线粒体损伤、蛋白质紊乱和神经炎症反应等病理变化。在局灶性脑缺血发展进程中，EAA 的神经毒作用是脑缺血损伤发生级联反应、自由基过度表达等恶性循环的主要诱发因素，最终可导致细胞凋亡。

1.5 钙超载 目前缺血脑组织发生的钙超载可导致细胞线粒体过度渗透，从而引起细胞凋亡，被广泛认为是在CIRI 过程中造成损伤的致病机制之一［20-21］。有研究显示，当脑细胞缺血缺氧时，物质能量转换下降可引起细胞内Ca2+水平失衡、膜去极化，激活其中的Ca2+通道，使得大量细胞外的Ca2+进入细胞内，导致细胞凋亡。该过程主要可通过激活胱天蛋白酶、钙依赖性蛋白酶及核酸内切酶而发生。此外，钙超载会进一步增加氧自由基释放并激活各种Ca2+依赖性酶，这些酶可破坏细胞质膜并溶解各种蛋白质中的肽键而使得细胞最终程序性死亡，细胞凋亡过多又进一步导致脑组织缺血缺氧，造成恶性循环。

1.6 炎症反应 剧烈的炎症反应可造成炎性级联反应，导致脑缺血面积扩大、神经细胞凋亡发生及加重［22-23］。参与机体炎症反应的物质包括炎症细胞（如白细胞、小胶质细胞等）、炎症介质、TNF-α 及白细胞介素（IL，如IL-1、IL-6 等）。脑缺血发生后，炎症细胞大量聚集，释放炎症介质，而IL-6 是在小胶质细胞过度表达后生成的具有多种生物学活性的细胞因子，能激活更多种类炎症介质，造成脑缺血继发性损害，诱导细胞凋亡。TNF-α 是多肽类细胞因子，亦可诱导多种炎症细胞活化，引发脑缺血后一系列继发性损害，诱导细胞凋亡。

2 中药活性成分干预CIRI后细胞凋亡的作用机制

近年来研究发现［24］，中医药治疗CIRI 疗效确切，不良反应小，对于遏制CIRI的进展具有重要作用。其中，多种中药活性成分可介导CIRI后细胞凋亡相关因子的活性，下调神经细胞凋亡率，挖掘中药活性成分，研制新药已成为治疗CIRI的新策略［25］。

2.1 益气健脾中药活性成分 中医认为，脾主运化，为后天之本。脾虚不能化生水谷精微并布散精微于全身脏腑，可致脑脉运行不利，邪气乘虚侵入，脑脉痹阻而发为中风，故临证治疗中风常运用益气健脾类中药。毛蕊异黄酮主要提取自中药黄芪，具有调节免疫、抗癌等活性［26］。张彐宁等［27］通过在大鼠体内模拟CIRI环境，发现毛蕊异黄酮可介导Cyt C/Apaf-1 凋亡信号通路，抑制Caspase-9 和Caspase-3 表达，降低神经细胞凋亡率，从而改善CIRI。人参皂苷为人参的主要活性成分。刘楠［28］采用人参皂苷干预CIRI 大鼠模型，发现神经元细胞内Bcl-2 和癌基因（c-Abl）表达均升高，Bax 和Caspase-3 含量降低，证实人参皂苷可减轻CIRI 状态下的神经元凋亡，以此发挥治疗作用。橄榄苦苷属于环烯醚类葡萄糖苷，具有多种生物学活性［29］。徐祖清等［30］发现运用从油橄榄叶中提取的橄榄苦苷干预CIRI 大鼠，可抑制JNK/p38 MAPK 信号通路，降低Caspase-3、Bax mRNA 及蛋白表达，上调Bcl-2 表达，证实了橄榄苦苷可减轻神经元细胞凋亡，对CIRI大鼠具有保护作用。金丝桃苷在金丝桃科、蔷薇科、豆科等植物中广泛存在。江飞飞等［31］研究发现，金丝桃苷能够抑制TLR4/COX-2信号通路，从而抑制Caspase-3、Caspase-9 以及Bax 蛋白的表达，提高Bcl-2 蛋白含量，下调神经元细胞凋亡率，能起到防治CIRI 的疗效。上述研究结果表明，毛蕊异黄酮、人参皂苷、橄榄苦苷和金丝桃苷等益气健脾中药活性成分可通过调控多种凋亡途径，抑制神经细胞凋亡，从而起到防治CIRI的作用。

2.2 补益肝肾中药活性成分 肝体失养，肾精不足，水不涵木，肝肾阴亏则肝阳上亢化风，发为中风，临床常应用补益肝肾药物，旨在滋阴潜阳，息风通络。白芍可养血柔肝，平抑肝阳，其有效成分白芍总苷具有良好的抗炎、抗凋亡等药理作用。代小兰等［32］研究发现，白芍总苷可降低神经元细胞Cleaved Caspase-12、Cleaved Caspase-3、TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平，可显著抑制缺血区细胞凋亡反应，结果提示白芍总苷可抑制大鼠神经细胞凋亡，缓解局部炎症反应，从而发挥治疗CIRI的作用。蒿本内酯提取于中药当归，前期研究已证实蒿本内酯对CIRI能起到神经保护作用，崔江波等［33］建立CIRI 大鼠模型，运用蒿本内酯干预，结果证实其可促进PI3K/AKT/mTOR通路信号传导，降低Bax、caspase3蛋白表达，显著下调细胞凋亡率，从而发挥神经保护作用。仙茅苷是中药仙茅的有效活性成分，实验证实CIRI 大鼠经仙茅苷干预后，脑组织中JAK/STAT1 通路信号传导中断，Caspase-3、Caspase-9及Bax 表达下降，Bcl-2 表达明显增高，提示仙茅苷能抑制细胞凋亡反应［34］。淫羊藿次苷Ⅱ是中药淫羊藿的有效活性成分，具有多种活性效应。实验发现［35］，淫羊藿次苷Ⅱ可明显抑制CIRI 大鼠神经细胞Bax、Cleaved Caspase 9、IL-1及TNF-α 的表达，增强Bcl-2、p62 蛋白表达，表明淫羊藿次苷Ⅱ能有效下调神经细胞凋亡率，遏制CIRI 进展。另外，还有研究发现淫羊藿苷可激活CIRI大鼠脑组织中PI3K/Akt信号通路，下调神经细胞凋亡率，修复受损神经［36］。马钱苷是中药山茱萸中的环烯醚萜苷类化合物。研究表明［37］，马钱苷可减轻线粒体和内质网损伤，下调凋亡执行蛋白Caspase-3 表达，减少神经元凋亡，从而发挥治疗CIRI小鼠的作用。

上述研究结果表明，白芍总苷、蒿本内酯、仙茅苷、淫羊藿次苷Ⅱ、淫羊藿苷和马钱苷等补益肝肾中药活性成分，可通过调控凋亡相关蛋白表达，下调神经细胞凋亡率，改善神经损伤，达到治疗CIRI的目的。

2.3 息风化痰中药活性成分 中医认为CIRI 的发生与经络瘀阻、气血逆乱、风痰上扰具有密切关系，故息风化痰通络是本病的重要治法。《本草纲目》载：“天麻乃定风草，故为治风之神药。”罗苑等［38］研究证明天麻醇提物可抑制CIRI 神经元细胞Bax 表达，上调Bcl-2 表达，从而修复神经功能缺损，减轻神经元细胞凋亡，最终起到保护神经细胞的作用。天麻总酚是中药天麻的主要有效活性成分，实验证实［39］天麻总酚可抑制CIRI大鼠脑组织中的MyD88/NF-κB/TNF-α信号通路，降低P62、Bax、TNF-α、MCP-1、IL-1β mRNA 及蛋白表达，下调神经元凋亡率，改善组织炎症损伤。可见，天麻醇和天麻总酚等息风通络药物活性成分可通过介导调亡通路活性、下调细胞凋亡率来改善脑组织损伤。

2.4 清热解毒中药活性成分 中风的阳闭证可表现为热象证候，临床常治以清热解毒法。尖叶假龙胆有效成分雏菊叶龙胆酮具有保肝、抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用［40］。胡晓阳等［41］通过实验，发现CIRI 模型大鼠经尖叶假龙胆有效组分乙醇提取物干预后，Bcl-2 蛋白含量升高，Bax 和Caspase-3含量降低，IL-1、IL-6含量降低，表明其可通过减轻细胞凋亡及调节免疫反应起到抗CIRI 的作用。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶儿茶素主要功能成分之一。实验表明［42］，EGCG 可通过调控MALAT1/miR-2115-3p 通路，抑制Bax 蛋白水平表达，上调Bcl-2 蛋白表达，显著降低神经元细胞凋亡率，发挥治疗CIRI的作用。大黄主要有效成分为大黄素，潘峰等［43］研究显示，大黄素可降低ERK1/2信号通路活性，使Cleaved caspase-3、Bax 蛋白表达受到显著抑制，Bcl-2 蛋白含量升高，表明大黄素可通过抑制神经细胞凋亡发挥治疗CIRI 的作用。以上研究表明，尖叶假龙胆、表没食子儿茶素没食子酸酯和大黄素等清热解毒中药活性成分主要通过调控凋亡相关蛋白表达，抑制神经细胞凋亡，从而改善CIRI。

2.5 活血化瘀中药活性成分 中医认为，瘀血日久不去则脉道不通，血不归经则出血不止，采用活血化瘀法治疗中风可通利血脉，促使气血运行，脑髓得养。丹皮酚是中药牡丹皮的主要活性成分。赵辉等［44］通过建立大鼠CIRI 模型，发现丹皮酚可显著抑制Bax 蛋白表达，而促进Hsp-70 和Bcl-2 蛋白产生，遏制CIRI 后的神经细胞凋亡，从而阻断病情的进一步发展。川芎具有活血行气功效，川芎嗪为无色针状结晶，主要提取自川芎。研究证实［45］，川芎嗪可降低CIRI 大鼠NF-κB 信号通路活性，抑制凋亡执行蛋白Caspase-3、TNF-α 表达，具有明显的抗炎、抗凋亡作用。莪术醇是莪术的活性成分之一，具有抗炎和抑癌活性作用［46］。研究表明，莪术醇能够调控SIRT1/FoxO1通路，使CIRI 大鼠脑组织Cas 3/Cas 3 蛋白、Cleav Cas 9/Cas 9、丙二醛（MDA）水平降低，而超氧化物岐化酶（SOD）水平显著升高，从而治疗大鼠CIRI［47］。李素萍等［48］研究发现，莪术醇可调节JNK1通路，降低海马神经细胞凋亡，从而缓解大鼠CIRI损伤。以上研究证实丹皮酚、川芎嗪和莪术醇等活血化瘀类中药活性成分可通过调控促凋亡因子与抗凋亡因子比例，遏制神经细胞凋亡，从而阻断CIRI的进展。

2.6 其他 除上述中药活性成分之外，自然界还存在多种植物，虽不能归属于传统中药，但研究发现其活性成分能有效抑制CIRI 后细胞凋亡。比如木犀草素广泛存在各种蔬菜中，具有保护心脑血管、免疫调节等活性作用。实验证实，木犀草素可抑制CIRI 大鼠JAK2/STAT3 信号通路活化，降低TNF-α、IL-6、IL-1β、Bax、Caspase-3 含量，提高脑组织Bcl-2 含量，从而减弱组织炎症反应及神经细胞凋亡，起到减轻CIRI 的作用［49］。原花青素可提取自多种植物。研究显示，CIRI大鼠经原花青素处理后，TLR4/NF-κB信号通路受到抑制，SOD、GPX含量降低、Bcl-2蛋白含量升高，表明原花青素可抑制神经细胞凋亡，具有缓解CIRI的作用［50］。

可见众多中药活性成分可抑制神经细胞凋亡，对CIRI 大鼠的神经保护具有积极作用，为中医药防治CIRI 提供了丰富的实验证据与研究思路。

3 结论与展望

随着社会经济发展，人类饮食结构和生活方式发生了改变，脑卒中发病率日益升高且发病年龄趋于年轻化，该病已成为当前卫生领域重点关注的研究方向之一。细胞凋亡是CIRI 疾病发生和发展的重要危险因素和CIRI 发生的主要机制之一，也是遏制CIRI 发展的关键环节。近年来，中药活性成分干预治疗CIRI的研究取得了较大进展，主要机制是通过调控促凋亡因子/抑凋亡因子比例，抑制神经细胞凋亡，进而延缓CIRI进展，这在微观层面上证实了中医药治疗CIRI的有效性和科学性。但中药活性成分治疗CIRI 的相关研究仍存在一定局限性：一方面，研究通路和靶点的局限性，目前的研究多局限于线粒体凋亡途径上，尤其集中于对Bcl-2 家族的调控，研究方向较单一。另一方面，目前该领域的研究主要集中于细胞及动物实验层面，缺乏大样本、多中心的临床对照研究，缺乏更具有说服力的循证医学证据。总之，中药活性成分抑制CIRI细胞凋亡的研究在近年取得了一定进展，但仍存在一定的局限性，在今后的研究应着力于深入阐明相关中药成分的作用机制，为中药防治CIRI提供更为有力的依据。