腺垂体细胞促性腺激素分泌及其体外培养研究进展

2023-06-03李泽廷苏少锋乔健敏马跃军孙培培赵俊利吴海青

畜牧与饲料科学 2023年5期

李泽廷，苏少锋，乔健敏，马跃军，孙培培，赵俊利，吴海青

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；2.内蒙古草原同源牧业有限公司，内蒙古呼和浩特

010020）

下丘脑-垂体-性腺轴属于神经内分泌系统的一部分，发挥重要的生殖调控作用。垂体受到来自下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）调控，继而分泌促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）和促黄体素（luteinizing hormone，LH），这两种激素共同调控性腺的发育。 FSH 和LH 共同调控卵巢性激素的分泌，同时，中枢生殖激素的合成与分泌又受卵巢激素的反馈调节。当下丘脑GnRH 合成增加促进FSH 和LH 的分泌时，称为正反馈（positive feedback）；当FSH 和LH 的分泌量增加到一定程度时会导致下丘脑GnRH 合成减少，称为负反馈（negative feedback）。

垂体作为下丘脑-垂体-性腺轴中的重要组成部分，通过结缔组织包裹的被膜隔开，一部分是主要由神经细胞组成的神经垂体，另一部分是由分泌激素的细胞组成的腺垂体。腺垂体是垂体分泌激素的主要部位，也是机体重要的内分泌腺。促性腺激素FSH 和LH 在动物的生殖发育过程中起着重要作用。FSH 可以促进卵巢的生长、卵泡内膜细胞的分化以及颗粒细胞的增殖，进而促进卵泡细胞的生长和发育。 FSH 和LH 的共同作用也可以促进卵泡的生长发育并排出优势卵泡，因此，腺垂体细胞的体外培养对于研究促性腺激素（gonadotropin，Gn）的分泌机制显得尤为重要。细胞的体外培养可以避开体内复杂环境因素的影响，腺垂体细胞的体外培养更容易揭示FSH 和LH 的分泌机理。笔者介绍了腺垂体在脑室中所处的位置以及腺垂体细胞的类型和主要分泌的激素，综述了腺垂体细胞的分离培养和鉴定方法，以及外源药物对体外培养腺垂体细胞分泌Gn 影响的研究进展，以期为深入研究下丘脑-垂体-卵巢轴的功能及机制，优化与完善腺垂体细胞体外培养体系，筛选Gn 分泌调节药物提供参考。

1 腺垂体的位置

腺垂体属于垂体的一部分。垂体主要由前叶、中叶和后叶构成，前叶通常指腺垂体，后叶通常指神经垂体。垂体前叶是垂体性激素分泌的主要部位；中叶主要合成促黑素；后叶本身并不产生激素，而是从下丘脑接收并储存抗利尿激素（antidiuretic hormone，ADH）和催产素（oxytocin，OXT），然后释放到血液中。动物的繁殖和发育受到来自腺垂体分泌的FSH 和LH 的共同调控。

2 腺垂体细胞的类型及主要分泌的激素

2.1 腺垂体细胞的类型

腺垂体中细胞类型多样，包括FSH 细胞、LH细胞、促乳素（prolactin，PRL）细胞、生长激素（growth hormone，GH）细胞、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）细胞、促甲状腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）细胞。细胞的类型不同，其分泌的激素也不同。

2.2 腺垂体细胞主要分泌的激素

腺垂体细胞的主要作用是分泌性激素，主要包括FSH、LH 和PRL。Gn 主要促进腺垂体合成及释放FSH 和LH，Gn 脉冲频率和振幅直接对FSH和LH 的合成产生影响，在低脉冲频率下优先刺激FSH 分泌，在高脉冲频率下优先刺激LH 分泌。GnRH 也可以直接作用于性腺，但对性腺的作用是抑制性的。

2.2.1 FSH

FSH 是由ɑ 亚基和β 亚基构成的糖蛋白激素，2 个亚基由共价键结合。促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）属于G 蛋白偶联受体。 FSH 只有与靶细胞膜上的FSHR 结合才能发挥生物学作用。在雌性动物中，FSH 可以明显促进卵泡和卵巢的生长发育。雌激素与FSH联合作用可促进颗粒细胞增殖、子宫内膜细胞分化、卵泡腔增大，促进卵泡发育。在雄性动物中，FSH 有利于精子的发育成熟。通过与FSHR 的相互作用，FSH 作用于雄性动物细胞中的独特靶点，即位于睾丸生精小管基膜上的支持细胞，这些细胞可以促进精原细胞增殖［1-2］。在成年小鼠睾丸中，FSH 刺激支持细胞产生抗凋亡因子和黏附分子，促进生殖细胞成熟［3-4］。 FSH 的缺乏会导致支持细胞数量减少［5-6］。研究发现，FSH 与睾丸的重量也有关，从体外培养的水牛犊牛腺垂体细胞中提取的FSH 以不同剂量注射到雄性兔子体内，与对照组相比，低剂量和高剂量的FSH 均增加了睾丸重量，提高了血清FSH 含量［7］。

2.2.2 LH

LH 是由ɑ 亚基和β 亚基构成的糖蛋白激素，稳定性通常较好，在提取和纯化过程中比FSH 稳定，在雌性动物中可以促进卵泡发育、诱导排卵以及促进黄体形成。在发情周期过程中LH 和FSH协同作用促进卵泡发育，当卵泡发育接近成熟时，LH 水平达到峰值从而诱发排卵。 LH 可以促进雄性动物睾丸间质细胞增殖，睾丸间质细胞分泌雄激素和生长因子，这些物质共同作用诱导副性腺发育、精子成熟以及睾酮合成［8］。 LH、FSH 和睾酮三者的共同作用可以促进ACTH 细胞和TSH 细胞的完全成熟。由此可见，FSH 和LH 在动物繁殖机能调控方面起到重要作用。

2.2.3 PRL

PRL 细胞主要分泌PRL。 PRL 是由199 个氨基酸残基组成的单链蛋白质。在雌性动物中PRL最主要的功能是促进乳腺发育和泌乳［9］；在雄性动物中，PRL 可增加间质细胞上促黄体素受体（luteinizing hormone receptor，LHR）的数量［10］，通过支持细胞增加FSHR 的数量［11］。 PRL 在骨组织中也发挥一定的作用［12-13］。

3 腺垂体细胞的体外培养

垂体结构较小且功能较为复杂，通过体外培养腺垂体细胞可以更好地了解其激素分泌功能。为了得到数量更多且活力较好的腺垂体细胞，研究者们在摸索腺垂体细胞分离培养最佳方法的基础上，探索传代培养、纯化培养、维持培养等不同培养方法的最佳条件。

3.1 腺垂体细胞的分离培养方法

腺垂体细胞的分离培养方法主要有机械法和机械+酶消化法。机械法通常是将已经分离出来的腺垂体用剪刀剪成糊状，然后将组织块和液体放入试管，在细胞筛上过滤碾磨成液体，得到细胞悬浮液，最后将其接种于细胞培养皿中。郑慧媛等［14］研究表明，采用机械法分离培养腺垂体细胞，可以在较短的时间内获得细胞，但是对细胞损伤较大，得到的细胞存活率较低。机械+酶消化法是指将腺垂体剪成小块转入离心管中，之后加入消化酶或者Ⅳ型胶原酶进行消化，离心后弃上清液，最后接种于细胞培养皿中。杨地等［15］采用机械+酶消化法分离腺垂体细胞，在腺垂体剪碎之后加入Ⅳ型胶原酶进行消化，一定时间后将液体通过细胞筛进行过滤，得到细胞悬浮液，最后将其接种于细胞培养皿中，得到的细胞存活率较高。蒋小飞等［16］比较了几种SD 大鼠腺垂体细胞分离培养方法的效果，发现采用机械+酶消化法获得的腺垂体细胞数量较多且活力较高。尹慧勇等［17］在山羊腺垂体细胞培养基中分别添加胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶、 Ⅳ型胶原酶和透明质酸酶进行消化，将细胞悬浮液铺板培养，培养结束后采用免疫细胞化学法进行鉴定；通过对细胞消化结果和腺垂体细胞的生长特性进行比较，发现山羊腺垂体组织在37 ℃条件下以Ⅳ型胶原酶和透明质酸酶混合消化2.5～3 h，腺垂体细胞的消化效果最好，细胞通常在24 h 开始贴于培养皿底部生长，在72 h 后细胞大量增殖连接成团，形态多为多角形或梭形，培养6 d 左右细胞基本覆盖铺满培养皿底部。

单独使用胰蛋白酶获得的细胞数量少，液体黏性较大，消化效果差；单独使用胶原酶获得的细胞数量多，但是液体黏性大，不易过滤；单独使用Ⅳ型胶原酶或胰蛋白酶获得的细胞存活率较低，液体黏性大，不易过滤。对比以上方法，机械法配合Ⅳ型胶原酶+透明质酸酶消化法分离腺垂体细胞的效果较好，细胞分离培养后的活力较高且存活率较高。

3.2 腺垂体细胞的体外培养

合适的体外培养条件有利于分离后的腺垂体细胞维持活性及分泌特性，为建立腺垂体体外细胞模型提供可模拟体内环境的有利条件。史继新等［18］研究了小鼠垂体前叶细胞体外培养的3 种方法：传代培养、纯化培养和维持培养。

传代培养是指待细胞长满细胞培养瓶底部时，使用胰蛋白酶进行消化，离心后将细胞重新铺板的培养方法。传代培养时腺垂体细胞增殖速度较快，通常在24 h 内贴于培养皿底部，48 h 后呈对数生长，大约7 d 后需要继续进行传代培养。培养的腺垂体细胞形态接近圆形或多角形，较大的腺垂体细胞可逐渐形成细胞团，随着培养时间的延长，腺垂体细胞数量逐渐减少，采用倒置显微镜观察可以看到大量长梭形和不规则形态的细胞。通过多次传代培养，腺垂体细胞数量有明显的下降，细胞会发生一定程度的变性。

纯化培养是指利用成纤维细胞先贴壁以及对胰蛋白酶消化较上皮细胞敏感的原理对腺垂体细胞进行纯化的培养方法。该方法可以增加腺垂体细胞的数量，但是纯化培养后细胞需要经历的过程较长，大约需要持续48～72 h。在细胞贴壁的前几天，可以看到大量的细胞处于分裂期，继续培养形成的细胞团才会逐渐增加，同时穿插有少量的长梭形细胞，长期培养容易导致细胞变性。

维持培养是指将细胞悬液接种于细胞培养瓶中，每3 d 更换1 次培养液，持续培养30 d 的培养方法。该方法培养时间较长，会影响细胞的生长与活性。通过比较以上3 种方法，可以采用纯化培养的方式进行腺垂体细胞的体外培养。

为了优化培养体系，研究者在模拟微重力条件下对大鼠腺垂体细胞进行三维培养，发现三维培养条件下的腺垂体细胞比二维培养更接近体内环境，同时可以避免体内环境的复杂性，是一种理想的细胞培养系统。研究发现，微重力在促进细胞分化方面具有优势［19-21］。宁泽乾［22］研究表明，应用模拟微重力对腺垂体细胞进行三维培养，腺垂体细胞比普通细胞增殖更快且细胞活力较好，因此，可以通过微重力三维培养方式进行腺垂体细胞培养。

4 腺垂体细胞的鉴定

腺垂体细胞的鉴定主要包括形态学、细胞学以及分子生物学方面的鉴定。形态学鉴定通过利用倒置显微镜观察细胞形态，腺垂体细胞刚贴壁时呈现圆形或不规则形态，完全贴满细胞培养瓶底部需要5 d 左右，此时大多数细胞呈现多角形或梭形。细胞学鉴定主要有免疫组化法和免疫荧光法；通过免疫组化法观察FSH 和PRL 等阳性细胞染色结果，FSH 阳性细胞的细胞质为蓝色，PRL阳性细胞的细胞质为蓝褐色；经免疫荧光染色的FSH 阳性细胞在荧光显微镜下细胞质呈现绿色荧光，细胞核呈现蓝色荧光。分子生物学鉴定是指基因水平的鉴定，通过设计FSH、LH、PRL 等基因引物序列，利用PCR 扩增目的基因后进行凝胶电泳检测，观察凝胶特定位置上有无符合预期大小的条带，有条带可证明FSH、LH、PRL 等基因有表达，再通过qPCR 分析FSH、LH、PRL 等基因的表达水平。针对FSH、PRL、LH 等标记基因的PCR 方法可以用于鉴定腺垂体细胞。

5 培养基中添加外源物质对腺垂体细胞分泌Gn的影响

腺垂体细胞体外培养基中添加外源物质的研究主要集中在外源物质对FSH 和LH 分泌量的影响。添加不同的外源物质对FSH 和LH 的作用不同，主要分为两大类：一类是促进FSH 和LH 分泌，包括GnRH 激动剂戈那瑞林［23］、瘦素［24-27］、中药［28］、雌二醇［29］、甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）［30］、蜂花粉［31］等；另一类是抑制FSH 和LH 分泌，如GnRH 拮抗剂Antarelix［32］、脂联素［33］和阿片肽类物质［34］等。

5.1 促进Gn 分泌的物质及作用机理

GnRH 激动剂戈那瑞林是一种人工合成的GnRH 类似物，通过影响下丘脑-垂体的功能，促进动物的垂体前叶释放FSH 和LH。王文华［23］研究表明，在体外培养腺垂体细胞体系中添加戈那瑞林，可使FSH 和LH 分泌量显著提高。

瘦素属于肥胖基因的蛋白产物，动物繁殖发育过程中体内能量平衡和内分泌功能受到瘦素的调控。黄荷凤［24］推测瘦素促进GnRH 分泌的传导机制是通过突触系统影响GnRH 的分泌。体外培养研究结果发现，瘦素可以直接促进动物腺垂体分泌LH 和FSH［25-27］。

补肾助孕方是一服由多种中药组成的临床药方，对体外培养的腺垂体细胞增殖有显著促进作用，能显著提高大鼠腺垂体细胞FSH 和LH 分泌水平［28］。

雌二醇是一种重要的性类固醇激素，可促进FSH 和LH 的分泌，通过激活腺苷酸环化酶/环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A 通路，磷脂酶C/肌醇1，3，5-三磷酸/蛋白激酶C 通路和Ca2+/钙调蛋白/CaM 依赖性蛋白激酶Ⅱ通路诱导FSHβ 和LHβ的表达，从而促进FSH 和LH 的合成和分泌。转录组测序分析发现，雌二醇可以显著上调草鱼垂体细胞中28 个基因的表达，这些基因参与了生殖、性腺发育和中央神经系统发育等多种生物学功能［29］。

MβCD 也可以刺激腺垂体细胞激素的分泌，具有激活生育和生殖功能的作用。在哺乳动物的原代培养腺垂体细胞中发现MβCD 可诱导LH 释放。研究表明，利用10-2mol/L 的MβCD 刺激牛垂体前叶细胞，可以促进LH 和FSH 的分泌［30］。

蜂花粉是一种独特的营养添加剂，通过下丘脑-垂体-性腺轴发挥作用。公鸡体内和体外腺垂体细胞的培养试验发现，蜂花粉可以促进FSH 和LH 的分泌，从而改善繁殖性能［31］。

以上研究表明，在体外培养条件下，激素、中药、糖类等均可刺激腺垂体细胞分泌Gn。