基于电喷雾质谱的多酚加合离子

谢 飞，陈满堂，王 昇，谢复炜，余晶晶，刘瑞红，王晓瑜，刘绍锋，刘惠民

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）具有分离效率高、分析速度快、应用范围广，不受样品挥发性和热稳定性限制等优势，且分析过程前处理简单，可以避免衍生化等繁杂的预处理，在烟草中糖类［1］、氨基酸［2-5］、有机酸［1］、Amadori 化合物［5-6］和多酚［7-8］等化合物的定性和定量分析方面得到了广泛应用。然而，现有LC-MS技术对未知化合物进行结构鉴定仍面临挑战，这是由于在离子化过程中，有些物质可与流动相中的离子产生高丰度的加合离子，而准分子离子［M-H］-和［M+H］+的丰度较低，导致对未知化合物的识别具有不可避免的模糊性。

长期以来，复杂的加合离子形式被认为是LC-MS 分析过程中的一个缺陷，为尽量避免其影响，研究者们采取了不同的策略：①采用负离子模式对可能在正离子模式下产生竞争性加合离子的分析物进行定性和定量。Muzaffar 等［9］采用负离子电喷雾电离模式对大鼠血浆样品中阿普斯特进行定量分析，以避免离子化过程中竞争性地产生加合离子。②在流动相中加入不易与分析物形成加合离子的盐。Hirabayashi等［10］通过在流动相中加入碳酸铵来定量洋地黄类强心苷类药物地高辛，减少分析物与有机酸（如乙酸盐、甲酸盐和三氟乙酸盐）的加合离子。需要注意的是，有研究表明，不同的加合形式也具有一定的优势，如辅助化合物的定性定量分析［11-13］。Hadavi等［14］将加合离子的形成作为分离巯基尿酸同分异构体和立体异构体的策略，结果表明，加合离子的形成促进同分异构体与立体异构体产生不同的分子构象，有利于异构体的分离鉴定。此外，Ducati等［15］采用碰撞诱导解离法（CID）和电子诱导解离法（EID）对药物和内源性代谢物进行LC-MS 分析，结果表明，多数分析物的碱金属离子加合物EID 谱图中出现了自由基阳离子M+及电子型碰撞碎片，因此提出了采用NIST-EI 谱库辅助LC-MS 鉴定代谢物的可能性。考虑到加合离子的两面性，系统研究加合离子的形成对LC-MS 定性定量分析至关重要。多酚类化合物对烟草色泽、品质和烟气的生理强度具有重要影响，是衡量烟草质量的重要指标［16-17］，而对多酚加合离子的系统研究尚未见报道。因此，本研究中基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术系统研究了绿原酸、莨菪亭和芸香苷3种多酚在正/负离子电喷雾电离模式下形成的加合离子，探讨不同流动相组成对加合离子形式、丰度和强度的影响，以期为基于LC-MS 的烟草多酚定性定量分析提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

绿原酸、莨菪亭、芸香苷（>98%），甲醇（>99.9%）（德国Merck 公司）；乙腈（>99.9%，美国J T Baker 公司）；甲酸（>98%，上海安谱实验科技股份有限公司）；乙酸铵（>98%，美国ROE公司）。

1290 Infinity II分析液相色谱仪（美国Agilent公司）；AB SCIEX TripleTOFTM4600 飞行时间质谱仪，Analyst 1.6 工作站，SCIEX OS-Q 定性定量软件（美国AB SCIEX 公司）；Atlantis@T3 色谱柱（美国Waters 公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）；CPA225D 型电子天平（感量0.000 01 g，德国Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 多酚标准工作溶液配制

准确称取各多酚成分标准品100 mg（精确至0.01 mg），用50%甲醇溶液溶解，定容至100 mL，配制成1 000 mg/L的单一标准储备液。采用50%甲醇溶液将各储备液稀释至1 mg/L的标准工作溶液。

1.2.2 多酚加合离子分析

取各标准工作溶液按以下方法进行UPLCQ-TOF/MS分析。

A.色谱条件

色谱柱：Atlantis@T3柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL。选用3种溶液为流动相A，分别是：a.水、b.0.1%甲酸溶液、c.含5 mmol/L 乙酸铵的0.1%甲酸溶液，流动相B 为乙腈；等度洗脱：85%A。

B.质谱条件

离子源：ESI；扫描方式：正负离子分别扫描；扫描范围：m/z100～1 000；去簇电压（DP）：40 V；喷雾电压（IS）：5.5 kV；雾化气压力（GS1）：0.38 MPa；气帘气压力（CUR）：0.24 MPa；辅助气压力（GS2）：0.34 MPa；离子源温度：500 ℃；碰撞能量：10 eV；检测模式：信息关联采集模式（IDA）。

2 结果与讨论

2.1 多酚在负离子模式下的加合离子

2.1.1 加合离子形式及丰度

不同流动相组成对绿原酸、莨菪亭和芸香苷等3种多酚在负离子模式下检出加合离子形式及丰度的影响见图1。当以水为流动相A 时，3 种多酚的质谱图中均未检出除脱质子准分子离子［M-H］-以外的加合离子。当在水相中添加甲酸后，莨菪亭的质谱图中仅出现［M-H］-的峰，绿原酸的质谱图中出现了氯加合离子［M+Cl］-（所占比例为0.71%）、甲酸根加合离子［M+FA-H］-（所占比例为0.33%）和二聚体脱质子离子［2M-H］-（所占比例为0.54%）的峰，芸香苷的质谱图中出现了［M+Cl］-（所占比例为2.25%）和三氟乙酸根（Trifluoroacetate）加合离子［M+TFA-H］-（所占比例为1.32%）的峰。［M+TFA-H］-的形成是因为三氟乙酸在HPLC方法中常作添加剂使用，在LC装置中可以存在较长时间，而［M+Cl］-的形成，则可能源于质谱入口处的盐沉积［18］。需要注意的是，当在水相中添加甲酸后，仅检出甲酸根（Formate）与绿原酸形成的加合离子，且丰度较低，表明多酚的［M+FA-H］-加合离子不稳定，这也是［M-H］-丰度最高的可能原因之一。在水相中继续添加乙酸铵后，检出的莨菪亭和芸香苷加合离子形式不变，对绿原酸则新增检出了［M+TFA-H］-（所占比例为0.13%），加合离子的相对丰度无明显变化。由此可见，在负离子模式下，不同流动相组成对绿原酸和芸香苷加合离子的形式有一定程度的影响，对加合离子相对丰度的影响不明显。此外，3 种多酚的主要离子形式［M-H］-在各流动相条件下，相对丰度均超过96%，对定量的影响有限；但需要注意的是，不同流动相组成下加合离子形式的差异对定性的影响。

图1 多酚在负离子模式下检出的离子形式及丰度Fig.1 Forms and abundances of polyphenol adduct ions in negative mode

2.1.2 加合离子的强度

加合离子的强度是影响分析物定性和定量的重要因素。由图1可知，多酚在负离子模式下主要的加合离子形式为准分子离子［M－H］-。因此，对不同流动相条件下［M-H］-的强度进行了讨论。不同流动相组成对3种多酚在负离子模式下［M-H］-峰响应强度的影响见图2，结果显示，当以水为流动相A时，3种多酚［M-H］-的响应强度为绿原酸＞莨菪亭＞芸香苷；当水相中加入甲酸后，绿原酸［M-H］-的响应强度明显降低（降低42.47%），莨菪亭［M-H］-的响应强度轻微降低（降低9.35%），芸香苷［M-H］-的响应强度明显升高（升高141.78%）；继续向水相中加入乙酸铵后，绿原酸、莨菪亭和芸香苷［M-H］-的响应强度均有一定程度的降低，分别降低66.03%、59.91%和74.59%。对比可知，以纯水为流动相A时，绿原酸和莨菪亭［M-H］-的响应强度较高，有利于检出；以0.1%甲酸溶液为流动相A时，芸香苷［M-H］-的响应强度较高，利于检出。考虑到不同流动相组成下加合离子形式和响应强度的差异对定性和定量仍会产生不同程度的影响，在实际应用中应保持流动相组成的一致和稳定。

图2 多酚在负离子模式下［M-H］-的峰强度Fig.2 Intensities of［M-H］- peaks for polyphenols in negative mode

2.2 多酚在正离子模式下的加合离子

2.2.1 加合离子形式及丰度

不同流动相组成对绿原酸、莨菪亭和芸香苷等3种多酚在正离子模式下检出加合离子形式及丰度的影响见图3。在3种流动相体系下，绿原酸和芸香苷的质谱图中均出现质子化准分子离子［M+H］+、钠加合离子［M+Na］+和钾加合离子［M+K］+峰，莨菪亭的质谱图中出现［M+H］+和［M+Na］+峰，表明在正离子模式下不同流动相组成对多酚加合离子的形式无明显影响。钠加合离子的形成可以用Na+的普遍存在解释，其可以来源于玻璃器皿、分析样品，以及分析物和溶剂中的杂质［19］。当以水为流动相A 时，绿原酸［M+Na］+（所占比例为70.48%）的丰度高于［M+H］+（所占比例为25.96%）和［M+K］+（所占比例为3.57%）；芸香苷［M+H］+（所占比例为72.45%）的丰度高于［M+Na］+（所占比例为25.73%）和［M+K］+（所占比例为1.81%）；莨菪亭［M+H］+（所占比例为98.42%）的丰度显著高于［M+Na］+（所占比例为1.58%）。当在水相中添加甲酸后，绿原酸和芸香苷［M+Na］+的相对丰度显著下降，分别下降至8.81%和7.41%；与此同时，［M+H］+的相对丰度分别上升至90.06%和91.85%。在水相中继续添加乙酸铵后，加合离子的相对丰度变化不明显。由此可见，在正离子模式下，除准分子离子［M+H］+外，绿原酸和芸香苷［M+Na］+的相对丰度也较高，这对分析物的定性和定量均具有一定的影响。此外，不同流动相组成对多酚加合离子的相对丰度影响较大，且该影响也与多酚的结构相关，例如，对绿原酸和芸香苷影响较大，而对莨菪亭的影响不明显。

图3 多酚在正离子模式下检出的离子形式及丰度Fig.3 Forms and abundances of polyphenol adduct ions in positive mode

2.2.2 加合离子的强度

不同流动相组成对3 种多酚在正离子模式下［M+H］+和［M+Na］+强度的影响见图4。结果显示，当以水为流动相A 时，3 种多酚［M+H］+的响应强度为莨菪亭＞芸香苷＞绿原酸；［M+Na］+的响应强度为绿原酸≈芸香苷＞莨菪亭。当水相中加入甲酸后，绿原酸和芸香苷［M+H］+的响应强度升高（分别升高297.66%和81.91%），莨菪亭［M+H］+的响应强度降低（降低22.93%）；绿原酸、莨菪亭和芸香苷［M+Na］+的响应强度分别降低85.67%、67.22%和58.69%。继续向水相中加入乙酸铵后，［M+H］+和［M+Na］+的响应强度均有所降低，降低的百分比为41.88%～78.32%。对比可知，以纯水为流动相A时，3种多酚［M+Na］+的响应强度较高，且此时［M+Na］+的丰度也较高，该流动相条件有利于［M+Na］+的检出。以0.1%甲酸溶液为流动相A 时，绿原酸和芸香苷［M+H］+的响应强度较高，且此时［M+H］+的丰度也较高，该流动相条件有利于绿原酸和芸香苷的定性和定量分析。考虑到在3 种流动相体系下，［M+H］+均为莨菪亭的绝对主要形式（＞98%），［M+Na］+加合离子的形成对莨菪亭定性和定量的影响均可以忽略不计；以纯水为流动相A 时，莨菪亭［M+H］+的响应强度最高，该流动相条件更利于莨菪亭的定量分析。

图4 多酚在正离子模式下［M+H］+和［M+Na］+的响应强度Fig.4 Intensities of［M+H］+ and［M+Na］+ ionsfor polyphenols in positive mode

2.2.3 不同加合形式的二级质谱碎片离子

二级质谱中的碎片离子是分析物准确定性的关键依据之一。多酚［M+H］+和［M+Na］+的二级质谱碎片离子见表1，其中，莨菪亭［M+Na］+丰度较低，未检出其碎片离子。对绿原酸［M+H］+仅检出m/z=163.038 3的碎片离子，对［M+Na］+检出m/z=163.038 5和m/z=215.050 2两种碎片离子。离子的碎裂机制如图5所示。对芸香苷［M+H］+和［M+Na］+检出了不同的碎片离子，［M+H］+和［M+Na］+的碎裂机制如图6所示。由图6 可推测［M+Na］+的形成改变了电荷的密度和分布，进而产生了不同的碎片离子。对不同加合形式碎裂机制的解析，有助于化合物的结构鉴定，提高定性的准确性。

表1 多酚［M+H］+和［M+Na］+的碎片离子Tab.1 Fragment ions of［M+H］+ and［M+Na］+for polyphenols

图5 绿原酸［M+H］+和［M+Na］+的碎裂机制Fig.5 Fragmentation pattern of［M+H］+ and［M+Na］+ ions for chlorogenic acid

图6 芸香苷［M+H］+和［M+Na］+的碎裂机制Fig.6 Fragmentation pattern of［M+H］+ and［M+Na］+ ions for rutoside

3 结论

①负离子模式下，多酚［M-H］-的相对丰度非常高，其他形式加合离子的相对丰度较低，流动相条件的变化仅对［M-H］-的响应强度影响显著，使用负离子模式是一种减少多酚加合离子影响的分析策略。②正离子模式下，［M+H］+和［M+Na］+是两种主要的加合形式，其相对丰度和强度受流动相组成和多酚结构的影响。③同种多酚［M+H］+和［M+Na］+在二级质谱中的碎裂机制不同，能够提供更丰富的质谱信息，对其碎裂机制的研究能够提高结构鉴定的准确性。