近红外光谱技术在烟用香精招标质量评价中的应用

郑 健，邓发达，，张晰祥，吴志英，沈 怡，李 力，崔 韬，闻 静，潘 凌，丁 为，陶飞燕，，周志刚，罗 诚，肖 岚，杨 涓*

1.四川中烟工业有限责任公司技术中心，成都市锦江区成龙大道56 号 610066

2.四川三联新材料有限公司香精香料事业部，成都市锦江区成龙大道56 号 610066

烟用香精香料的质量一致性影响产品设计、加工制造及卷烟成品的一致性。目前，通常采用物理指标和感官指标相结合的方法进行烟用香精香料的一致性评价。近年来，随着统计分析技术的广泛使用，色谱指纹技术［1-3］、质谱［4-5］、电子鼻［6］、近红外［7-8］、红外［9-10］、紫外［11］和拉曼光谱［12］等分析方法越来越多地应用于烟用香精香料的一致性评价。一般来说，样品的一致性评价应综合考虑如下因素：实验条件、分析目的、分析周期、样本量和准确性。在不同的应用场景下，需采用不同的评价策略。

烟用香精招标过程的质量一致性评价有如下特点：样本少、品种多，样品量大，需要判断准确，但不需要解释样品差异原因。常规理化指标难以全面表征香精质量一致性，感官评价易受人的主观性影响，且短时间内完成大量样品的感官检测会导致人疲倦，影响结果的准确性。色谱指纹分析技术具有准确性和灵敏度较高的优点，但针对不同类型样品尚无统一的前处理手段和标准的操作规范；另外，以上分析手段检测周期长，在招标要求时间内完成几百乃至上千样品分析较难实现。近红外光谱技术分析过程简洁、快速，无污染，其定性分析具有整体性和模糊性的特点［13］，在行业内得到广泛应用。近红外光谱技术在香精香料领域大多应用于品质控制［14-15］，对建模样本数量有一定要求，与招标样本少的实际情况有一定差异。叶亚军等［15］使用近红外光谱结合相似度分析法建立了烟用香精品控模型，对5个招标香精型号进行判定，但应用于大规模香精招标质量评价效果未知。张学博等［16］的研究表明，采用光谱相似度匹配的方法可以很好地解决样品一致性评价问题，但分析对象为药品，成分单一，与烟用香精有较大差异。因此，亟需一种快速分析方法，以满足烟用香精招标过程中质量评价的需求。为此，本研究中采取近红外光谱技术，建立香精香料质量判别模型，旨在建立一种香精香料质量相似性快速评价方法，为招标质量评价提供一种快速、准确和灵敏度高的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟用香精A（表香）和B（料香）（用于配制干扰实验样品）、不加香空白烟支由四川中烟工业有限责任公司提供；16种86个烟用香精仿香实验样品（包括16个最新到货合格样品和70个仿配香精样品）、395个烟用香精标准样品及1 428个库存样品（用于建模）、2 000个投标样品均由四川三联新材料有限公司提供。

乙醇（AR），正己烷（HPLC），乙腈（HPLC）（美国Fisher 公司）；甲酸（HPLC），乙酸苯乙酯（AR）（美国Tedia公司）；丙二醇（AR，上海阿拉丁公司）；2-甲基萘（AR，上海泰坦科技公司）；超纯水（自制，电阻率≥18.2 MΩ·cm）；0.45 μm 有机相滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

QuasIR 3000 傅里叶变换近红外光谱仪及配套液体扫描附件（美国Galaxy 公司）；配有FID 的Clarus 500 气相色谱仪（美国PerkinElmer 公司）；配有紫外检测器的1260 高效液相色谱仪、DB-5MS 弹性毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）（美国Agilent 公司）；ME204 电子天平（感量0.000 1 g）、DR45 密度折光仪、DL50 电位滴定仪（瑞士Mettler Toledo 公司）；Symmetry®C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Waters 公司）；烟用香精料液品质控制系统V1.0（郑州烟草研究院）。

1.2 方法

1.2.1 近红外光谱采集

在室温条件下，将光谱仪开机预热2 h 稳定后，按照仪器操作手册规定，诊断仪器性能，校验仪器状态。取一定量的样品（以铺满样品池为准）放入样品池中进行近红外光谱扫描。扫描波段：4 000～12 000 cm-1，分辨率：8 cm-1，扫描次数：64次，采集方式为漫透射。每次光谱采集后，用水或酒精彻底清洁样品池及压杆。

1.2.2 光谱预处理方法和波长选择

近红外光谱分析是从复杂的背景中提取有用信息，光谱原始数据中除含有样品自身的信息外，还包含其他无关因素带来的干扰［17］，如样品的状态、杂散光及仪器响应等的影响。光谱预处理的目的就是消除光谱数据的无关信息和噪声，提高光谱数据与化学成分的相关性，获得高信噪比、低背景干扰的分析信号，从而提高建模效果。因此，在建立模型时，对光谱数据进行预处理是十分必要和关键的，常用的预处理方法有矢量归一化、标准正态变换（Standard Normal Variate，SNV）、一阶导数化和最大最小归一化等。

波长选择可以去除噪音和冗余信息，找出最有效的光谱区域，使模型更加简单稳定。

按照公式（1）计算多条光谱每个波长点吸光度的标准偏差，得到方差光谱：

式中：SS 是方差光谱；n是光谱数；Xi是光谱吸光度；是光谱吸光度均值。

方差光谱能反映光谱的离散程度，同一样品的方差光谱越小说明光谱一致性越好；不同样品的方差光谱值大的谱段，就是光谱特征信息强的谱段。以此进行光谱预处理方法和波长选择。

将同一香精样品重复扫描9次，分别计算原始光谱、经一阶导数、SNV和一阶导数+SNV预处理之后光谱的方差光谱。

将200个不同的样品分别扫描，计算其方差光谱。

1.2.3 香精近红外光谱相似性匹配度计算

一致性评价是一种快捷的图谱比较方法［18-19］，通过比较待测样品的光谱与已知样品的参考光谱是否具有一致性，从而判断待测样品与已知样品是否具有一致的样品质量［16］。在近红外分析中，当多次测量相同的样品时，得到的并不是平移的光谱，而是有局部伸缩的光谱，这是由于物质在不同波长处的响应强度不同，变异范围不同而造成的。建模过程中如果不考虑这种变异，将所有波长点同等对待，在使用模型时可能出现较多误报警［20］。一致性评价方法以标样在不同波长点的标准差σ标样，j为基础建立模型，可很好地解决这个问题。在某一个波长点j处，香精检验光谱在j波长处的一致性指数（CI）按照公式（2）计算：

式中：X样品，j是待测光谱吸光度；X标样，j是参考光谱吸光度均值；σ标样，j是标样在不同波长点的标准差。

采用t 分布置信水平方法确定单波长的CI 阈值，则累积概率（p）可由公式（3）计算：

式中：k是自由度（光谱数－1）；x是随机变量。

如果单个波长点合格的概率为p，那么m个波长同时合格的概率（P）按照公式（4）计算［21］：

式中：m是波长点数。

结合公式（3）和公式（4），则有

按公式（6）计算香精相似性匹配度（M，%）值：

式中：M是香精与标样的相似性匹配度；OP 是超过CI 阈值范围的波长点数；TP 是建模区间总波长点数。M以百分制表示，其值越高，表示待测光谱与标样的一致性越好。

1.2.4 模型阈值确定

1.2.4.1 干扰样验证

将香精样品用溶剂稀释或用其他品种香精掺杂得到干扰实验样品。取香精A 和香精B 各3 个批次作为校正集样品（合格样品），每个批次随机从不同香精香料桶中收集样品，每批次约收集15 个，共计90 个建模样品。将验证集样品分为两组，一组以香精A 为本底按1%、2%、4%、10%、20%的梯度分别加入乙醇和香精B（作为杂质）混合均匀共计12 个，另一组以香精B为本底按同样的梯度分别加入乙醇和香精A（作为杂质）混合均匀共计12个，总共24个验证样品，进行近红外光谱扫描并计算相似性匹配度。

1.2.4.2 仿配香精验证

对86个烟用香精仿香实验样品扫描后得近红外光谱并计算相似性匹配度。

1.2.5 建模方法比较

按照公式（7）计算夹角余弦［22］（C）值，考察近红外光谱的相似性，并与一致性评价方法进行比较。

式中：m是波长点数；Xj、Yj是光谱吸光度。

1.2.6 感官评价

香气评定按照YC/T 145.6—1998［23］中的方法制样，由7名具有专业经验的人员对试样和标样香气质量（包括香型、香气浓淡、强弱、持久性、杂气）的差异大小进行评价。香味评定按照YC/T 145.8—1998［24］中的方法制样，由7名具有专业经验的人员，对试样与标样进行对比评吸，从香气风格特征、舒适感特征、烟气特征形态相似度三方面进行评价。

1.2.7 理化指标测定

按照YC/T 145.1—2012［25］，YC/T 145.2—2012［26］，YC/T 145.3—2012［27］中的方法进行烟用香精的酸值、相对密度和折光指数的测定。

1.2.8 指纹图谱分析

1.2.8.1 气相色谱分析

称取1 g香精样品于50 mL具塞三角瓶中，精确至0.000 1 g，准确加入5 mL超纯水，摇匀，再准确加入5 mL含乙酸苯乙酯的正己烷萃取溶液，盖上塞子，机械震荡15 min；静止分层后取出正己烷相，即可进行仪器分析。若有乳化现象无法分层，可于3 000 r/min离心分离5 min再取样。分析条件：

载气：氦气；检测器：FID；进样口温度：280 ℃；检测器温度：280 ℃；柱流速：2.5 mL/min（恒流模式）；进样量：1 μL；分流比：10∶1；氢气流速：40 mL/min；空气流速：450 mL/min；升温程序：60 ℃（2 min）300 ℃（20 min）；采用内标法进行定量（待测物质量分数以对内标的相对校正因子为1计算）。

1.2.8.2 液相色谱分析

取适量2-甲基萘逐级稀释，配制浓度为2、10、50、100、200、500 μg/mL 的2-甲基萘标准溶液。将纯水、无水乙醇和丙二醇等体积混合后作为样品稀释溶液。准确称取0.5 g样品于10 mL容量瓶中（若样品浓度过大，可适量减少称样量），用样品稀释溶液溶解并定容。取适量溶液经有机相滤膜过滤，将滤液进行液相色谱分析。分析条件：

柱温：40 ℃；流量：1 mL/min；进样量：15 μL；检测波长：275 nm 或254 nm；洗脱方式：梯度洗脱；流动相A：0.1%甲酸（质量分数）；流动相B：乙腈。采用外标法（2-甲基萘）进行定量。

1.2.8.3 数据处理

采用烟用香精料液品质控制系统V1.0（郑州烟草研究院）进行数据处理。以标准样品的色谱数据为参比，以“大峰变化率”和“小峰夹角余弦”为评价指标，对样品与标准样品的相似度进行分析评价。

（1）大峰变化率：“大峰”指单个色谱峰峰面积大于所有峰面积总和10%的高质量分数成分的色谱峰。“大峰变化率”是待测样品高质量分数成分与标准样品相应成分的峰面积比值；该值越接近于1表示待测样品中高质量分数成分与标准样品相应成分的质量分数越接近。

（2）小峰夹角余弦：“小峰”指单个色谱峰面积小于总峰面积10%的低质量分数成分的色谱峰。“小峰夹角余弦”反映待测样品所有小峰与标准样品所有小峰的整体相似度；该值越接近于1表示待测样品中低质量分数成分与标准样品低质量分数成分的整体相似度越高。

2 结果与讨论

2.1 光谱预处理方法选择

标准正态变换（SNV）可以减少颗粒大小、表面散射及光程变化等因素对漫反射光谱的影响，一阶导数是经常使用的基线校正和光谱分辨预处理方法［28］。对原始光谱及经一阶导数、SNV和一阶导数+SNV预处理之后的光谱，归一化后考察其方差光谱（图1）。可以看出：一阶导数、一阶导数+SNV 预处理后的方差光谱值明显低于无预处理和SNV 处理，说明一阶导数、一阶导数+SNV预处理方法更优。计算各预处理方法的方差光谱均值（表1），结果表明，一阶导数+SNV 方法的方差光谱均值最小，使同一样品光谱具有很好的一致性。因此，对大部分烟用香精建模时选取了一阶导数+SNV的方法进行光谱预处理。

表1 同一种烟用香精样品不同预处理方法的方差光谱均值Tab.1 Means of variance spectra of the same tobacco flavor sample pretreated by different methods

图1 同一种烟用香精样品不同预处理方法的方差光谱图Fig.1 Variance spectra of the same tobacco flavor sample pretreated by different methods

2.2 波长选择

图2为不同烟用香精样品的近红外谱图，可以看出，不同样品在4 000～7 500 cm-1内有较强吸收，且表现出较大差异。从不同香精样品的方差光谱（图3）来看，4 000～7 500 cm-1谱段标准偏差较大，说明此谱段内有强信号；8 000～9 000 cm-1谱段标准偏差较小，有较弱信号；9 000～12 000 cm-1谱段标准偏差接近零值，此谱段内基本只有噪声信息。因此，在排除干扰并尽可能保留光谱有用信息的原则下，建模选择的波长范围为4 000～9 000 cm-1（1 180 个波长点）。需要说明的是，不同的烟用香精模型可以在此范围选择不同的谱段。

图2 不同烟用香精样品的近红外光谱图Fig.2 Near-infrared spectra of different tobacco flavor samples

图3 不同烟用香精样品的方差光谱图Fig.3 Variance spectra of different tobacco flavor samples

2.3 模型CI阈值

根据公式（5），当m=1 000时，CI值随建模样本数的变化趋势如图4所示。可知，随着样本数的增加，CI值快速减小。当样本数大于10时，CI值趋于稳定。因此，一致性评价方法中，采用较少样本建模是可行的。

图4 CI值随样本数的变化趋势Fig.4 Variation trends of CI value with number of samples

烟用香精样品一致性评价过程中，品控和招标是两个不同的应用场景。品控的目的是发现样品中少量的不合格样品，招标的目的是发现样品中少量的合格样品。在控制图［29］中表现为：当控制限划定后，品控样品在控制限内的概率大，招标样品在控制限内的概率小。

图5 为CI 值随P值的变化图。可知，如果品控模型使用时不合格样品少于5%，则要求CI 值大于7.19，为图5 中红色框内区域；如果招标模型使用时合格样品少于5%，则要求CI 值小于4.03，为图5 中蓝色框内区域。后续建立的香精香料定性模型，在大多数情况下，取CI值等于3。

图5 CI值随P值的变化趋势Fig.5 Variation trend of CI value with P value

2.4 模型相似性匹配度阈值

2.4.1 干扰样验证

扫描干扰实验样的近红外光谱并计算光谱的相似性匹配度，同时进行香气嗅辨评价，结果见表2。可以看出，随着稀释和掺杂比例增加，香精A 和B 干扰样相似性匹配度依次减小，近红外方法能够表征干扰样的微小质量差异。与香气嗅辨评价相比，近红外方法更灵敏。当M值大于90%时，香气嗅辨可能分辨不出差异；但M值小于90%时，香气嗅辨均可分辨出差异，说明将阈值设为90%，“拒真”的概率极低。因此，初定近红外相似性匹配度的阈值为90%。

表2 香精干扰实验样品验证结果Tab.2 Validation results of flavor samples in interference testing

2.4.2 仿配香精验证

实际上，仿香样品的干扰因素更多，通常不限于一种溶剂或杂质。因此，对16种仿香实验样品进行模拟招标评价。16种样品中均为合格样的近红外光谱的M值最高，介于95.47%～100%之间。仿配香精M值普遍较低，仅有4.65%的仿配香精的M值大于90%；M值小于90%的样品100%是伪样，实现直接剔除。由仿配香精M值分布（图6）可见，大部分仿配香精的M值低于80%。16 种样品中16 个合格样的匹配度均高于90%，且有14 种样品中只有合格样的M值高于90%，结合2.4.1节干扰样验证实验结果，将招标样品匹配度阈值设置为90%。匹配度高于90%的样品与标样质量一致性较好，应用近红外相似性评价模型对烟用香精进行招标质量评价初筛，具有可行性。当出现多个样品的M值大于90%时，应根据实际情况采取感官评价、理化指标检测和色谱分析等手段进一步确证。

图6 仿配香精近红外光谱相似性匹配度分布Fig.6 Matching degree distribution of near-infrared spectrum similarity of imitation flavors

2.5 建模方法比较

夹角余弦是评价光谱相似性的常用统计学方法。为进一步验证模型效果，对这2种光谱相似性评价方法进行了比较（表3）。结果表明：一致性评价结果与2.4.1 节中干扰实验样品添加比例符合度最高，优于夹角余弦法。

表3 近红外光谱不同相似性评价方法比较Tab.3 Comparison of evaluation methods for different near-infrared spectra similarities

2.6 模型建立

采集395 种烟用香精批次留样样品和标样共1 823 个香精样品的近红外光谱，按上述方法建立395种烟用香精近红外光谱定性判别分析模型。

2.7 烟用香精招标质量评价

对2 000 个烟用香精投标样品进行质量评价，395种香精中，92.2%的香精（364种）仅有1个投标样品M值大于90%，且与感官评价结果一致，实现了快速准确的评价。

结合感官评价、理化指标和色谱分析对剩余31种香精质量一致性确认。实际上，剩余香精型号可根据M值的大小，筛选出合格样品。部分剩余香精型号感官指标无法区分的投标样品近红外光谱分析和理化指标、色谱指纹分析结果见表4。可知，当某种香精有多个投标样品M值大于90%时，在感官和物理指标无法判别的情况下，M值最高的样品总是合格样品。

表4 部分投标样品的近红外光谱、物理指标和色谱指纹图谱分析结果Tab.4 Results of near-infrared spectra，physical indices and chromatographic fingerprints of some tender samples

3 结论

①采用近红外方法，建立了395种烟用香精的一致性评价模型；②采用干扰样和仿配香精对模型进行了验证，将近红外光谱相似性匹配度（M）阈值设置为90%，M值小于90%的样品100%是伪样，实现直接剔除；③将模型应用于395种烟用香精的招标评价，有92.2%的投标样品（364种）可实现快速准确的判别。该方法快速准确、实用性强，适宜作为香精香料招标质量评价的快检手段。