施用生石灰对酸化植烟土壤细菌群落结构和代谢功能的影响

施河丽，向必坤，朱宗第，左 梅，彭五星，尹忠春，王 刚，陶德欣，付 裕，陆承念，谭 军*

1.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北省恩施市施州大道119 号 445000

2.中国烟草总公司湖北省公司，武汉市硚口区宝丰路6 号 430030

土壤酸化可对农业生产和生态环境造成严重危害，不仅会加速土壤养分的流失，使土壤肥力下降［1］，导致农作物减产，农产品品质下降，同时还会使土壤中铝、锰和镉等毒性元素的活性增加，使得农作物对有害元素的吸收量增加［2］，此外还会破坏土壤微生态平衡，使得病原物蔓延，大大加重了青枯病等土传病害的发生［3-6］。土壤酸化是一个长期、渐进的过程，在全国范围内普遍发生，南方地区尤为严重［7］。

受气候环境、种植制度和施肥等因素的影响［8］，近年来烟区植烟土壤酸化问题日趋严重。植烟土壤酸化后通过自身作用难以修复，只能采用轮作、合理配施肥料以及施用生石灰、生物质炭等改良剂的方法进行改良。其中，施用生石灰是烟区改良酸性土壤，防控烟草青枯病［9-10］，提高烟叶产质量和安全性的有效措施［11-12］，目前在烟区推广较多，技术较为成熟。前人的研究已经证实，合理施用生石灰可提高土壤pH，增加土壤有效养分含量［13-14］，对改善酸化土壤微生态环境具有积极作用。淡俊豪等［15］研究发现，施用生石灰对酸性土壤微生物群落功能多样性的提高有较大的促进作用；梁军伟［16］通过研究初步阐明了生石灰在皖南烟区酸性土壤中的改良效果，土壤细菌多样性显著增加。烟草青枯病是烟区发生最普遍、危害最严重的土传病害之一，其发生与土壤微生物群落之间关系密切［17］，改善土壤微生态环境是防控烟草青枯病的一条有效途径［18］。为进一步明确生石灰通过改善酸化土壤微生态环境降低烟草青枯病发生的可能原因，通过高通量测序技术分析施用生石灰对酸化土壤细菌群落代谢功能的影响以及土壤细菌群落与环境因子的关系，以期为生石灰在烟叶生产中的合理施用以及烟草青枯病的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验点基本情况

试验于2020—2021年在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩县椒园镇水井坳村进行。试验地为烟草连作10 年以上，烟草青枯病发病率达60%以上烟田。田块地理坐标为东经109.38°，北纬29.97°，海拔1 004 m，属亚热带季风性湿润型山地气候，年平均气温13.7 ℃，年平均降水量1 635.3 mm，无霜期263 d。土壤类型为山地黄棕壤，土壤质地为壤土，耕层土壤（0～20 cm）基本理化性质为：pH 5.19，有机质22.6 mg/kg，碱解氮117.9 mg/kg，有效磷104.5 mg/kg 和速效钾290.5 mg/kg。供试烤烟品种为云烟87，试验所用生石灰为当地市售。

1.2 试验设计

试验共设置4个处理，见表1。采用随机区组设计，3 次重复，行株距为1.20 m×0.55 m，每小区种植烤烟60株。田间管理按当地常规方法进行。

表1 试验设计Tab.1 Experimental design（kg·hm-2）

1.3 土壤样品采集

2021 年烟叶采收结束后，采用5 点取样法采集0～20 cm耕层土壤。每个处理3个重复，共计12个土壤样品。将采集的每个土壤样品分成两部分，分别放入标记好的自封袋中。一部分土样置于干冰中带回实验室，保存于-80 ℃冰箱，用于土壤微生物DNA提取；另一部分土样自然风干、去杂、研磨和过筛，用于测定土壤pH、有机质、碱解氮、有效磷、速效钾、交换性钙、交换性镁、可交换酸度、可交换氢和可交换铝等指标。

1.4 测定方法

1.4.1 田间病害调查

参照GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》［19］调查烟草青枯病发生情况，计算发病率、病情指数和防治效果。烟苗移栽后每隔30 d 调查1次，连续调查3次。

1.4.2 土壤化学性质测定

采用电位法测定土壤pH［20］；采用重铬酸钾容量法测定有机质含量（质量分数）［20］；采用扩散法测定碱解氮含量［21］；采用钼锑抗比色法测定有效磷含量［21］；采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定速效钾含量［21］；采用乙酸铵交换-原子吸收分光光度法测定交换性钙和交换性镁含量［21］；采用氯化钾提取-滴定法测定土壤可交换酸度、可交换氢和可交换铝含量［22］。

1.4.3 土壤微生物测序分析

提取土壤样品总DNA，以样品DNA 为模板，采用引物341F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′），806R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）对细菌16S rDNA V3-V4 区进行PCR扩增。PCR产物经检测合格后，利用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（美国Illumina 公司）进行文库构建，使用NovaSeq6000（美国Illumina 公司）测序平台进行测序（北京诺禾致源科技股份有限公司）。

1.5 数据处理

以97%的一致性将有效序列聚类成为OTUs（Operational taxonomic units，操作分类单元）。利用Mothur 方法与SILVA 138 的SSUrRNA 数据库对OTUs 序列进行物种注释分析。利用Qiime 软件（Version 1.9.1）计算Sobs（Observed species）、Shannon、Simpson、Chao1 和Ace 等多样性指数。利用SPSS 22.0 中的皮尔逊（Pearson）法分析土壤细菌群落多样性指数与土壤化学性质的相关性。利用典范对应分析（Canonical correspondence analysis，CCA）和Mantel test 分析影响土壤细菌群落的主要环境因子，在进行典范对应分析时，先剔除共线性严重的环境因子后再进行分析。利用Tax4Fun 工具对细菌群落功能进行预测［23］。部分数据整理与分析采用Excel 2010和DPS 15.0统计软件完成。

2 结果与分析

2.1 施用生石灰后烟草青枯病的发生情况

2020—2021年各处理烟草青枯病的发生情况见表2。2020年，移栽后30 d，T1处理（对照）的发病率和病情指数均显著高于T2、T3 和T4 处理，且T2、T3和T4 处理对烟草青枯病的防效分别为60.07%、89.93%和89.93%；移栽后60 d，T2、T3 和T4 处理对烟草青枯病的防效分别为21.03%、55.28%和44.72%；移栽后90 d，T2、T3和T4处理对烟草青枯病的防效分别为29.87%、40.27%和28.57%。2021 年，移栽后30 d，T2、T3 和T4 处理对烟草青枯病的防效分别为66.47%、100.00%和100.00%；移栽后60 d，T2、T3 和T4 处理对烟草青枯病的防效分别为28.46%、79.95%和46.70%；移栽后90 d，T2、T3 和T4处理对烟草青枯病的防效分别为26.10%、60.88%和36.97%。通过连续2 年的田间试验，说明施用生石灰有降低烟草青枯病发病率和病情指数的趋势。

表2 不同处理对烟草青枯病的防效①Tab.2 Control effects of different treatments on tobacco bacterial wilt

2.2 施用生石灰后土壤化学性质的变化

由表3 可见，T2 处理的土壤有机质含量显著高于T1 处理，T2 处理的土壤碱解氮含量显著高于T3处理。通过连续2年的田间试验，表明施用生石灰有提高酸化土壤pH、有机质、速效钾、交换性钙和交换性镁含量的趋势。

2.3 土壤细菌群落多样性分析

由表4 可见，T3 和T4 处理的Sobs 指数、Chao1指数和Ace 指数显著高于T1 和T2 处理，T2 处理的Sobs指数、Chao1指数和Ace指数显著高于T1处理，T3 和T4 处理的Shannon 指数显著高于T1 处理。以上结果表明，施用生石灰可提高酸化土壤细菌群落的多样性。

表4 不同处理土壤细菌群落多样性指数Tab.4 Diversity indexes of soil bacterial community under different treatments

2.4 土壤细菌群落多样性指数与土壤化学性质之间的关系

由表5 可见，土壤pH 与Sobs 指数、Shannon 指数、Simpson指数、Chao1指数和Ace指数呈显著正相关关系；土壤有效磷与Sobs 指数、Shannon 指数、Simpson 指数、Chao1 指数和Ace 指数呈显著负相关关系；土壤交换性钙与Sobs 指数、Shannon 指数、Chao1 指数和Ace 指数呈显著正相关关系。说明土壤pH、交换性钙和有效磷含量可能是影响酸化土壤细菌群落多样性的重要因子。

表5 土壤细菌群落多样性指数与土壤化学性质的相关性①Tab.5 Correlations between diversity indexes of soil bacterial community and soil chemical properties

2.5 土壤细菌群落物种组成及差异分析

对相对丰度占比前10 位的土壤细菌门进行了分析（表6），结果表明，不同处理土壤细菌群落在门水平上的相对丰度存在差异。施用生石灰后，变形菌门和芽单胞菌门等2 个土壤细菌门的相对丰度表现出降低的趋势，其中T4处理变形菌门和芽单胞菌门的相对丰度显著低于T1处理。施用生石灰后，放线菌门、绿弯菌门、黏球菌门和硝化螺旋菌门4个土壤细菌门的相对丰度表现出增加的趋势，其中T3和T4处理放线菌门、绿弯菌门和黏球菌门的相对丰度显著高于T1处理，T4处理硝化螺旋菌门的相对丰度显著高于T1 和T2 处理，T3 处理硝化螺旋菌门的相对丰度显著高于T2 处理。说明适量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可提高酸化土壤放线菌门、绿弯菌门和黏球菌门的相对丰度。

相对丰度高于1%的土壤细菌属共有12 个（表7）。与T1 处理相比，Ellin6067和Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia在T3和T4处理中的相对丰度显著降低；褚氏杆菌属在T2处理中的相对丰度显著高于T4处理；雷尔氏菌属和Bryobacter在T1和T2处理中的相对丰度显著高于T3处理。说明适量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可降低酸化土壤Ellin6067和Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia的相对丰度。

表7 土壤细菌群落主要属的相对丰度Tab.7 Relative abundance of major genus of soil bacterial community（%）

2.6 土壤细菌群落与环境因子的关系

通过方差膨胀因子剔除共线性严重的环境因子后，有8 个环境因子入选。由图1 可见，CCA1 和CCA2 累积解释变量可达69.45%（CCA1：45.53%，CCA2：23.92%），能够反映环境因子对土壤细菌群落结构的影响。CCA1与pH、交换性钙、交换性镁和可交换氢具有正相关关系，与碱解氮、速效钾和交换性铝负相关。由Mantel Test分析结果（表8）可知，pH、交换性钙、交换性镁和可交换铝对土壤门水平细菌群落结构具有显著的影响，可能是影响土壤细菌群落的重要环境因子。

图1 土壤门水平细菌群落与环境因子间的典范对应分析Fig.1 Canonical correspondence analysis between soil bacterial community and environmental factors at phylum level

表8 土壤门水平细菌群落与环境因子之间的Mantel test结果Tab.8 Mantel test results of relationships between soil bacterial community and environmental factors at phylum level

2.7 土壤细菌群落功能预测

为探究施用生石灰后土壤细菌的变化情况，通过Tax4Fun 软件进行细菌功能预测分析，结果获得一级功能分组6类，二级功能分组39类，其中相对丰度大于1.0%的二级功能分组有21 类。由表9 可见，一级功能分组中相对丰度排在前3位的是新陈代谢、遗传信息处理和环境信息处理，其占比分别为47.08%～47.48%、19.97%～20.25%和14.12%～14.55%。与T1处理相比，T4处理新陈代谢这1类一级功能分组的相对丰度显著增加；T3和T4处理遗传信息处理这1类一级功能分组的相对丰度显著增加，而环境信息处理和人类疾病这2类一级功能分组的相对丰度显著降低。适量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可增加遗传信息处理这1类一级功能分组的基因丰度，降低环境信息处理和人类疾病这2类一级功能分组的基因丰度。

表9 土壤细菌群落中一级功能分组的相对丰度Tab.9 Relative abundance of Level 1 functional groups in soil bacterial community（%）

由表10可见，相对丰度大于1.0%的21类二级功能分组中，涉及新陈代谢功能的有12项，涉及遗传信息处理功能的有4项，涉及环境信息处理功能的有2项，涉及细胞过程功能的有3 项。相对丰度大于5.0%的二级功能分组包含碳水化合物代谢、氨基酸代谢、翻译、复制与修复和膜运输这5 类。T1 和T2处理、T1 和T3 处理、T1 和T4 处理分别有0、6 和9 类二级功能分组存在显著差异；T2和T3处理、T2和T4处理分别有6和7类二级功能分组存在显著差异；T3和T4处理有1类二级功能分组存在显著差异。适量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可增加能量代谢、萜类和多酮类代谢、翻译和折叠、分类与降解这4类二级功能分组的基因丰度，降低膜运输这1类二级功能分组的基因丰度。

表10 土壤细菌群落中相对丰度大于1.0%的二级功能分组Tab.10 Level 2 functional groups with relative abundance greater than 1.0% in soil bacterial community（%）

3 讨论

生石灰处理酸化土壤后，可提升酸化土壤pH至烟草生长的适宜范围（pH 5.5～6.5），还可提高土壤交换性钙和交换性镁含量，且土壤交换性钙含量的提高幅度要远高于交换性镁，这可能是由于生石灰的主要成分是氧化钙，而氧化镁的含量较少，且该结果与胡敏等［24］报道的施入生石灰可提高土壤pH，改善土壤酸度，提高土壤交换性钙和交换性镁含量的结果相符。然而，长期大量施用生石灰会加剧土壤复酸化，导致土壤板结和钾、钙、镁等营养元素不平衡［25-26］，因此实际应用中应注意生石灰的用量，合理施用。

适量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）处理酸化土壤后，土壤中放线菌门、绿弯菌门和黏球菌门等优势菌群的相对丰度显著升高。其中，放线菌门作为土壤中主要门之一，能产生种类繁多的抗生素，对植物病害有明显的防治作用；绿弯菌门通常作用于土壤碳水化合物的水解，还参与了氮和硫等元素的生物地球化学循环过程［27］。因此，适量生石灰处理可通过提高土壤细菌群落的多样性和增加有益微生物的丰度显著改变酸化土壤微生物群落，从而提高酸化土壤的健康质量，这与张义杰等［28］施用生石灰调控三七酸化土壤的研究结果相符。土壤细菌群落与环境因子的关系分析结果表明，土壤pH、交换性钙、交换性镁和可交换铝可能是影响酸化土壤细菌群落的主要环境因子，其中以土壤pH最为重要。施用生石灰可提高酸性土壤pH、交换性钙和交换性镁含量，降低可交换铝含量，从而影响土壤细菌的数量、分布和组成，促进土壤生态系统的稳定，增加烟株对病原体入侵的抵抗力［29-30］，抑制烟草青枯病的发生。此外，本研究中发现，生石灰处理的烟草青枯病发病率和病情指数均低于对照处理，也证明了可通过对酸化土壤微生态的改善来减轻烟草青枯病的发生，从而说明土壤微生物群落结构与烟草青枯病的发生密切相关。

适量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）处理酸化土壤后，可增加土壤细菌群落能量代谢、萜类和多酮类代谢、翻译、折叠、分类与降解这4 类功能的基因丰度，降低膜运输功能的基因丰度，这表明生石灰在使土壤细菌群落结构发生改变的同时，也使土壤细菌代谢功能发生了相应变化。土壤细菌代谢功能活跃对植物生长极为重要，如能量代谢与摄取能量密切相关；通过萜类和多酮类代谢产生萜类和多酮类次生代谢物，大多数萜类化合物与植物的抗病性、抗逆性和各种生物相互作用有关［31］，许多多酮类化合物具有抗细菌、抗真菌、杀虫等活性［32］，这种代谢水平上的变化可能会抑制土壤中青枯病原菌的传播；而膜运输功能的降低，可能减弱了青枯病原菌的移动和侵染根系的速度［33-34］，抑制了烟草青枯病的发生。

4 结论

高通量测序分析表明，适量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）可提高酸化土壤细菌群落多样性；放线菌门、绿弯菌门和黏球菌门等有益菌群的相对丰度升高；增加能量代谢、萜类和多酮类代谢、翻译、折叠、分类与降解功能的基因丰度，降低膜运输功能的基因丰度。通过土壤细菌群落与环境因子的关系分析，确定了影响土壤细菌群落的主要环境因子是土壤pH、交换性钙、交换性镁和可交换铝，其中土壤pH是影响土壤细菌群落最重要的因子。适量生石灰（1 200～1 500 kg/hm2）在改善酸化植烟土壤细菌群落结构和代谢功能中具有积极作用，并能有效预防烟草青枯病的发生。