海南长臂猿粪便性激素水平报道

李威，卢学理，齐旭明，袁梨，黎华福，邓怀庆

（1.贵州师范大学生命科学学院，贵阳 550001；2.贵州师范大学喀斯特研究院，贵阳 550001；3.海南热带雨林国家公园管理局霸王岭分局，海南 昌江 572722；4.重庆动物园，重庆 400050）

海南长臂猿Nomascus hainanus属灵长目Primates 长臂猿科Hylobatidae 冠长臂猿属Nomascus，国家一级重点保护野生动物，中国特有种，被世界自然保护联盟（IUCN）列为极危（CR）等级（Geissmann & Bleisch，2020）。由于栖息地的丧失和破碎化、非法盗猎行为和人类活动的影响（周江，2008），海南省人民政府网（https：//www.hainan.gov.cn）的资料显示，目前仅剩36 只海南长臂猿，包括5 个家庭群（A、B、C、D、E）的31 只个体和5 只独猿，分布在海南热带雨林国家公园内（原霸王岭国家级自然保护区）中，栖息地面积约16 km2（Guoet al.，2021）。对海南长臂猿的保护研究尤为迫切。

现有关于海南长臂猿的研究主要集中在行为（周江，2008；周江等，2008；Zhouet al.，2008；Deng &Zhou，2016；Denget al.，2016；李萍等，2021）、生境选择（唐玮璐，金崑，2021）、食物组成（唐玮璐等，2021；Zhanget al.，2022）、遗传多样性（李志刚等，2010；Guoet al.，2020，2021）、肠道微生物多样性（Li Pet al.，2022；Yanget al.，2022）等方面。由于野生长臂猿常生活在栖息地地形复杂的环境，且营树栖生活方式，加上对人类的高度警惕，常难以对它们进行长期的实地研究（Bleisch & Chan，1991）。当前仍然缺乏有关海南长臂猿内分泌和生理健康监测的研究。

繁殖状况对物种保护、管理和恢复具有重要的意义，而监测灵长类动物的生理周期和性激素水平信息可以掌握其繁殖状况。雌雄正常生理周期的开始就意味着性成熟，其主要特征是在生理周期内雌性生殖器的肿胀（Dahl & Nadler，1992；Cheyne & Chivers，2006；Barelliet al.，2007）；观察雌性个体性器官的肿胀也曾被认为是监测生理周期的一个行之有效的方法（Nadleret al.，1993；Barelliet al.，2007）。然而，冠长臂猿属雌性长臂猿的性器官肿胀不明显，或只有轻微的粉红色阴唇肿胀（Heistermann，2010）；银白长臂猿Hylobates moloch雌性性器官的肿胀与生理周期并不一致（Hodgkiss，2007）。因此，雌性长臂猿性器官的肿胀不能作为生理周期开始的精确指标。

性激素影响着动物的一系列繁殖行为和发育的变化：孕酮是一种在人类和其他动物种类中参与雌性月经周期、妊娠期（促进妊娠）和胚胎发育的类固醇激素（Wishartet al.，2007）；睾酮能促进精子的产生、第二性征的发展和雄性的生殖竞争（Wingfieldet al.，1990），促进求偶和性行为（Wiley& Goldizen，2003）。孕酮的水平可以作为雌性生理周期的可靠标记，表明雌性确实在排卵（Wasseret al.，1988），测定孕酮水平能检测到雌性生殖状况的变化（即月经周期、怀孕）（Fießet al.，1999；Pineda-Galindoet al.，2017）。非人灵长类动物粪便中的睾酮水平在不同性别间具有显著差异（Möhleet al.，2002；Pineda-Galindoet al.，2017）。因此，本研究选择孕酮和睾酮开展研究。生理周期的长度通过从一个周期的最高激素浓度（峰值）到下一个周期的激素浓度峰值计算（Geissmann & Anzenberger，2009）。

监测在自然栖息地生活的濒危野生动物的繁殖和生理状况，通常采用非损伤性的方法，即检测其粪便等样品中的类固醇代谢物（Hodges & Heistermann，2003）。在开展野外研究时，通过粪便进行激素分析更灵活（Santymire & Armstrong，2010），与采集血液测量激素的传统方法相比，此法具有实用性，也具备伦理上的优势。尿液和粪便样本可以在不需要捕获或打扰动物的情况下反复收集，有利于对动物生殖活动的时间变化进行纵向评估（Brownet al.，1994）。

海南长臂猿通常在日出前后不久频繁而有规律地鸣叫，一般持续10～30 min，鸣叫和二重唱是其交流的一个重要方面（Denget al.，2014），野外跟踪时可通过鸣叫声靠近长臂猿。成年雌性金黄色的毛色使其更容易被发现，通过寻找成年雌性长臂猿更容易追踪到猿群。海南长臂猿的这些特征为野外条件下的实地跟踪和非损伤性采样提供了方便。在环境温度下储存的未经处理的粪便样本中，类固醇激素的浓度可能会随着时间的推移而变化，并由于粪便细菌的活动导致浓度的波动（Messmannet al.，1999；Khanet al.，2002；Shuttet al.，2012），因此，新鲜粪便样品采集后需要尽快进行实验处理或先低温储存。

量化各种样品中激素浓度的方法有放射免疫（RIA）和酶联免疫（EIA）测定法。这些方法依赖于使用与对应的激素（或其代谢物）结合的抗体，从而量化样本中的浓度（Grangeet al.，2014）。尽管具有特异性，EIA 的测量结果可能受到抗体与其他的结构相似的代谢物发生交叉反应的影响（Rinconet al.，2019）。免疫分析比高效液相色谱质谱联用法（LC-MS）更便宜、有更高的通量（Cross& Hornshaw，2016）。但与免疫分析相比，LC-MS不使用抗体进行激素检测，而是通过基于分子量和电荷对样本中的激素进行高度特异性的测量（Hauseret al.，2008；Cross & Hornshaw，2016），可准确量化样品中的激素水平，从而避免EIA法中抗体交叉反应带来的影响。鉴于对海南长臂猿保护的迫切需求，本研究通过采集海南长臂猿的新鲜粪便样品，采用LC-MS 分析其粪便中孕酮和睾酮的水平，为长臂猿繁殖生物学研究提供基础信息，为改善和加强海南长臂猿的保护管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

海南热带雨林国家公园霸王岭保护分局位于海南岛的西南部山区（109°03′～109°17′E，18°57′～19°11′N），海拔151～1 559 m，年均气温21.3 ℃，年均降水量1 657 mm（Deng & Zhou，2018）。属热带季风气候，干湿季明显，5—10月为雨季，11月至次年4月为旱季（龙文兴等，2011）。

1.2 目标动物

海南长臂猿粪便样品来自C家庭群，家域面积约为436 hm2，海拔780～1 270 m（Heet al.，2022）。野外采样期间，C 群共8只个体，包括3只成年雄性个体（CM01、CM02 和CM03）、2 只成年雌性个体（CF01 和CF02）、2 只青年个体（CJ01 和CJ02）和1只幼年个体。其中，CM01是家庭群首领，CF01和CF02 均是有繁殖经历的成年雌性（韩玲，2019）。由于幼年个体的排便量过少，很难寻找到新鲜粪便，无法长期持续地跟踪采集粪便样品，故不作为本次研究对象。

1.3 样品采集

在2021年的雨季（5—11月），每天在日出前到达C 群监听点，通过鸣叫判断海南长臂猿的位置，并尽可能靠近跟踪。根据体型大小、皮毛颜色等特征，结合鸣叫等行为进行个体识别。一旦观察到海南长臂猿排便，部分人员尽量靠近排便地点寻找新鲜粪便样品，其他人员继续追踪观察其他个体的排便情况。采样人员戴上一次性灭菌手套，用无菌移液枪枪头夹取新鲜粪便放入无菌培养皿中，再将培养皿置于相对平缓的地方，用一次性无菌手术刀切除污染部分样品，然后将剩余样品放入25 mL无菌管中密封储存，并记录采样日期和个体信息。将装有粪样的无菌管放入携带的小型液氮罐内低温储存，带回实验室-80 ℃保存。

1.4 实验设备和化学试剂

利用超高效液相色谱-串联质谱联用仪（UP LC-MS/MS）（ACQUITY UPLC-Xevo TQS，Waters Corp.，Milford，MA，USA）进行激素类物质检测。检测使用的化学试剂包括分析纯甲酸和目标激素标准品（St.Louis，MO，USA），以及质谱纯甲醇、乙腈、乙酸乙酯（FairLawn，NJ，USA）。实验用超纯水由装备有液质联用的0.22 μm 过滤头的Millipore Reference超纯水系统（Billerica，MA，USA）制备。精确称取激素标准品溶于乙醇溶液中，配成浓度为5.0 mg·mL-1的母液，随后用20%甲醇溶液稀释制成一系列浓度的标样获取标准曲线，浓度分别为0.01 nmol·L-1、0.05 nmol·L-1、0.10 nmol·L-1、0.50 nmol·L-1、1.00 nmol·L-1、5.00 nmol·L-1、15.00 nmol·L-1、40.00 nmol·L-1、80.00 nmol·L-1和200.00 nmol·L-1。

1.5 数据分析

海南长臂猿孕酮和睾酮水平用干粪便中目标激素含量（pmol·g-1）来表示。根据性别和年龄分为成 年 雄 性（CM01、CM02 和CM03）、成 年 雌 性（CF01和CF02）和青年3组（CJ01和CJ02）。

使用MassLynx（V4.1，Waters，USA）对UPLCMS/MS生成的原始数据文件进行处理，对每一个代谢物进行峰的积分、校准和定量，数据通过SPSS对成年雄性、成年雌性、青年个体之间的性激素水平进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和t检验，显著性水平设置为α=0.05。

2 研究结果

2.1 孕酮水平的分析

根据孕酮水平推测，CF01在6月4日—7月7日之间完成了1个月经周期，长度为33 d；在7月7日—8月4日完成了1 个月经周期，长度为27 d，平均为30 d±3 d。CF02 在6 月28 日—8 月4 日之间完成了1个月经周期，长度为37 d，在8月4日—9月5日之间完成了1 个月经周期，长度为32 d，平均为34.5 d±2.5 d（图1）。

图1 海南长臂猿C群成年雌性个体孕酮的时间动态变化Fig.1 Temporal dynamics of progesterone in adult female Hainan gibbon （Nomascus hainanus）group C

海南长臂猿C 群在不同性别和不同年龄间的孕酮水平均无显著差异（P＞0.05）；成年雄性、成年雌性和青年间也无显著差异（P＞0.05）（图2）。

图2 海南长臂猿C群的孕酮水平Fig.2 Progesterone levels of Hainan gibbon（Nomascus hainanus）group C

2.2 睾酮水平的分析

海南长臂猿C群的成年雌性、成年雄性和青年睾酮的时间动态变化没有观察到明显的周期性特点（图3）：成年雌性在睾酮水平上高于成年雄性且有显著差异（P＜0.05）；但是青年与成年雌性和成年雄性之间的睾酮水平均无显著性差异（P＞0.05）（图4）。

图3 海南长臂猿C群个体间睾酮的时间动态变化Fig.3 Temporal dynamics of testosterone among individuals in Hainan gibbon（Nomascus hainanus）group C

图4 海南长臂猿C群的睾酮水平Fig.4 Testosterone levels in Hainan gibbon（Nomascus hainanus）group C

3 讨论

本研究测定的海南长臂猿C 群2 只成年雌性CF01 和CF02 的 月 经 周 期 分 别 为30 d±3 d 和34.5 d±2.5 d。2013年，在7个北美动物机构的包括白颊长臂猿N.leucogenys、黄颊长臂猿N.gabriellae、合趾猿Symphalangus syndactylus和白掌长臂猿Hylobates lar在内的7 只长臂猿研究中发现，这些长臂猿在为期3 个月的研究中的平均月经周期为23.1 d±1.5 d，在不同个体和物种之间的范围是15.3～27.3 d（Rafaczet al.，2013）；黄颊长臂猿的平均月经周期为21.1 d±1.2 d（n=7）（Geissmann & Anzenberger，2009）。大多数报道的长臂猿月经周期为20～40 d，但是大于22 d 的平均值多数是基于对月经出血或观察交配行为得到的，Hodgkiss（2007）基于4只雌性银白长臂猿H.moloch的性激素水平研究指出其平均月经周期为25.4 d±8.4 d，其中包括一个长达38 d 的较长周期，认为雌性长臂猿最长的月经周期可达49 d。本研究基于海南长臂猿C 群2 只个体获得的月经周期比大多数基于性激素水平研究所得到的平均月经周期要长，还需通过后续增加群体观察以验证海南长臂猿的月经周期长度。

海南长臂猿成年雌性个体间的月经周期无显著差异，显示了一定程度的同步性。生活在一起的群居灵长类动物雌性的月经周期具有同步性现象较为常见（Mcclintock，1971，1984；Wallis，1985），这种现象被认为是由雌性的嗅觉信号调节的（Mcclintock，1978，1984；Russellet al.，1980）。生活在近距离的雌性长臂猿可能会影响彼此的月经周期（Geissmann & Anzenberger，2009），本研究结果支持这一结论。

在野生种群中，一夫一妻制和一夫多妻制都存在，若雌性有多个雄性性伴侣，繁殖行为是一种混淆父权的方式（Barelliet al.，2007）。过去海南长臂猿是一夫二妻制（Zhouet al.，2008），但雌性长臂猿对交配行为似乎有更高的控制权（Zhouet al.，2008；Geissmann & Anzenberger，2009）。当前海南长臂猿已形成多雄多雌的家庭结构（LiYMet al.，2022），该研究发现C 群成年雌性（CF02）在同一天向2只居住的成年雄性（CM01和CM02）求偶，并在不同日期与这2 只雄性分别交配。灵长类动物较长的月经周期可能是雌性一种混淆父权的适应性特征，从而降低雄性的杀婴风险，在与多个雄性生活在一起的雌性动物中，它们受到高度的性胁迫（van Schaiket al.，2000）。本研究中，2 只成年雌性长臂猿的月经周期比其他报道的更长，且被观察到与多个雄性交配的CF02 的月经周期略长于CF01。海南长臂猿是否通过延长月经周期混淆父权关系，需要今后结合行为学记录和性激素监测研究验证。此外，黑吼猴Alouatta pigra的粪便中睾酮水平在雄性和雌性之间存在显著差异（Ariadnaet al.，2014），本研究结果表明，海南长臂猿睾酮水平在两性之间也存在显著性差异。海南长臂猿的繁殖生物学信息对于了解其生存和保护现状至关重要。该物种分布地形复杂，营高大树栖生活，且生性隐蔽，尤其对人类高度警惕，不便于野外跟踪和新鲜粪样采集。因此，当前只采集了相对易于观察的C群海南长臂猿粪便样品，研究结果表明通过粪样的性激素水平分析，可以有效评估海南长臂猿的繁殖状况，这对种群数量极少的灵长类动物繁殖生物学研究具有一定的参考价值。