一株猕猴源唾液乳杆菌对DSS 诱导的结肠炎小鼠的影响

尚可，杨盛智，刘旭，宋佳蓉，范振鑫，岳碧松，李静

（四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610065）

猕猴Macaca mulatta是生物和医学领域中应用最广泛的非人灵长类动物，目前已在国内广泛圈养。腹泻是一类广泛发生的威胁圈养猕猴健康的疾病（顾宏伟，2021），其中，炎症性肠病是最普遍的慢性腹泻疾病，发病机制复杂，可能与遗传、环境等因素相关，尤其是肠道菌群被认为可能是腹泻易感性的主要因素（Fournieret al.，2020）。目前，猴场大多采取投喂广谱性抗生素的形式治疗慢性腹泻，但临床发现，该方式的治疗效果并不明显，且长期使用抗生素易使肠道致病菌产生耐药性，且有引发抗生素相关性腹泻的风险。因此，寻找抗生素的有效替代品，成为了生命科学与医学领域的关注焦点。

益生菌是指存在于肠道中的一类拥有维持肠屏障完整性、释放营养物质、调节免疫系统、平衡促炎因子和抗炎因子等功能的活性微生物（高可染等，2022）。益生菌与各类人类及动物疾病，如肠道疾病、糖尿病、心血管疾病及癌症等都密切相关（Varshaet al.，2021）。适当补充有益细菌后可使肠炎病情得到不同程度的缓解（张瑛，2010）。乳酸菌是人类和动物肠道菌群的主要组成部分之一，也被认为是一类经典的益生菌，具有调节胃肠道微生物组成、辅助治疗胃肠和其他多种疾病的功能。如一株泡菜源乳酸菌对酸诱导的小鼠急性结肠炎具有较强的抗炎活性，解剖学和组织病理学显示口服补充乳酸菌可改善急性结肠炎的症状（Sooet al.，2017）。某些乳酸菌菌株可产生维生素，它们在预防和治疗结肠炎、黏膜炎等炎症性疾病方面显示出了很好的效果（LeBlancet al.，2020）。

本课题组先前自健康猕猴粪便样品中分离获得了一株唾液乳杆菌Lactobacillus salivariusMK0901，本研究一方面探究了其体外益生特性，如溶血性、抗生素抗性、耐酸性、耐胆盐性、细胞黏附性和抑菌性等；另一方面，采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）诱导法构建结肠炎小鼠模型，以益生性已被广泛研究和认可的鼠李糖乳杆菌L.rhamnosusGG（LGG）作为阳性菌株，研究了该菌株对结肠炎症状的改善和动物肠道菌群的调节作用，从而全面评价其益生活性。

1 材料

1.1 实验菌株和细胞系

唾液乳杆菌MK0901 来自本课题组菌种库。溶血性葡萄球菌Staphylococcus haemolyticusATCC29970、大肠埃希氏菌Escherichia coliCMCC（B）44102、乙型副伤寒沙门氏菌Salmonella enterica serovarParatyphi B CMCC（B）50094、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureusCMCC（B）26003、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosaCMCC（B）10104 和鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosusATCC 53103购自益加生物科技成都有限公司。人结肠癌细胞（HT-29）细胞系由本学院细胞室提供。

1.2 实验动物

由成都达硕实验动物有限公司提供4 周龄SPF 级雄性昆明小鼠60 只［实验动物生产许可证号：SCXK（川）2020-030］，平均体重28.86 g，体重间无显著性差异。饲养于本实验室动物房中，实验流程按四川大学生命科学学院伦理委员会相关要求进行。正式实验前进行1周适应性饲养，饲养条件：湿度50%左右，温度24 ℃左右，每日光照与黑暗各12 h，及时添加饲料和饮用水，自由饮食饮水。

1.3 主要试剂

无菌DPBS 缓冲液、4%多聚甲醛固定液、氯化钠（分析纯）（白鲨生物），MRS 肉汤培养基、MRS 琼脂培养基、胰酪胨大豆肉汤培养基、哥伦比亚血平板（环凯生物），人工胃液、人工肠液、抗生素药敏纸片（四环素、氨苄西林、环丙沙星、头孢曲松、克林霉素、克拉霉素、庆大霉素、氯霉素）（上海源叶生物），葡聚糖硫酸钠（翌圣生物），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）检测试剂盒（江苏晶美生物），粪便DNA 提取试剂盒（天根生化科技）。

1.4 主要仪器及设备

高压蒸汽灭菌锅（上海申安）、生化培养箱（三洋电机）、无菌操作台（浙江苏净）、多功能酶标仪（Bio Tek）、超低温冰箱（海尔）。

2 方法

2.1 体外益生性评估

2.1.1 溶血性 将复苏、活化的MK0901 接种于哥伦比亚血平板，培养24 h 后观察其是否出现溶血环，并以溶血性葡萄球菌作为阳性对照。

2.1.2 耐酸、耐胆盐性和耐人工胃、肠液能力将单菌接种于pH3.0 和猪胆盐浓度0.3%的MRS 肉汤培养基中，37 ℃培养18 h后，吸取1 μL菌液点于MRS 琼脂平板上，37 ℃培养24 h，观测其是否结菌。确认可结菌后，将单菌接种于人工胃液中，菌液浓度调至约108CFU·mL-1，37 ℃培养3 h，用梯度稀释法进行活菌计数，同时吸取1 mL 培养的人工胃液于9 mL 的人工肠液中，继续培养3 h 后，再次进行活菌计数，并计算人工胃、肠液存活率。

2.1.3 抗生素抗性 使用无菌棉花蘸取菌液（浓度108CFU·mL-1）并均匀涂布于MRS 琼脂平板上。将抗生素药敏纸片贴于MRS 琼脂平板上，37 ℃培养24 h后，使用游标卡尺测定药敏圈直径。

2.1.4 细胞黏附性 挑单菌落接种于MRS 肉汤培养基中，37 ℃培 养24 h 后5 000 r·min-1离 心10 min，用PBS 缓冲液冲洗，将菌液浓度调至106CFU·mL-1。采用细菌与细胞共培的方法测试MK0901 对HT-29 的黏附性，培养时间为2 h（黏附率=共培后菌液浓度/共培前菌液浓度×100%）。

2.1.5 抑菌性 大肠埃希氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别接种于TSB 培养基，37 ℃培养24 h，备用。配制400 mL 营养琼脂培养基，灭菌后冷却至40 ℃左右，加入1 mL病原菌培养液，混匀后倒平板，待其凝固后用6 mm打孔器打孔，每孔加50 μL MK0901 发酵液上清，37 ℃培养24 h后测定抑菌圈直径。

2.2 对结肠炎小鼠的作用

2.2.1 结肠炎小鼠造模和动物分组 将试验菌株MK0901 与阳性对照菌株LGG 复苏并活化。将其置于-4 ℃、6 000 r·min-1离心5 min，弃掉上清液，收集菌泥。使用无菌PBS 缓冲液重悬菌体，调节菌液浓度达109CFU·mL-1，配制为灌胃用菌悬液，备用。60 只昆明雄性小鼠随机分为4 组：空白对照组（CK 组）、模型组（DSS 组）、LGG 组和MK0901 组。实验周期共16 d，分为造模期（8 d）和恢复期（8 d）。整个实验周期中，空白组每日提供正常水，自由饮用，每日每只小鼠灌胃0.2 mL 无菌生理盐水；实验组小鼠在造模期每天提供4%DSS自由饮用，在恢复期自由饮用正常水，每日每只DSS 组小鼠灌胃0.2 mL 无菌生理盐水，其余2 组则分别灌胃0.2 mL上述MK0901或LGG菌悬液。

2.2.2 小鼠体重变化率及免疫器官指数测定每日称量小鼠体重并绘制其变化曲线。实验结束日脱颈处死小鼠，迅速取出脾脏并用生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后称量。脾脏指数=脾脏重量（g）/小鼠体重（g）×100%。

2.2.3 结肠组织病理学表现 取小鼠结直肠，以盲肠为辨识标志测量其长。截取1 cm 结肠并用4%多聚甲醛固定液将其固定24 h。采用HE 染色法进行制片。用光学显微镜观察小鼠结肠组织的病理学表现。

2.2.4 血清炎症因子测定 采用眼眶取血法获得小鼠新鲜血样，将血样置于3 000 r·min-1离心10 min，收集血清。使用TNF-α、IL-1β 和IL-6 检测试剂盒，按照说明书测定炎症因子指标。

2.3 对结肠炎小鼠肠道菌群的影响

使用粪便基因组DNA 试剂盒提取粪便总DNA。使用PCR 扩增细菌16S rRNA基因V3-V4 高变区，扩增引物为338F（ACTCCTACGGGAGGCA GCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。采用Illumina MiSeq PE250平台完成16S rRNA基因扩增子测序，使用美吉生信云分析平台（https：//cloud.majorbio.com/）完成数据质控及分析。以相似度不低于97%为标准对物种序列进行聚类分析，统计各组OTU 数目；采用QIIME 中“diversity alpha-group-significance”计算Alpha 多样性指数；ggplot2 和vegan 包完成主坐标分析；物种丰度分析由ggplot2完成。

3 结果

3.1 MK0901体外评估结果

MK0901 的单菌落在哥伦比亚血平板上未形成溶血环，可耐受长达18 h 的高酸、高胆盐环境，且在耐受3 h 人工胃、肠液后的存活率为94.3%和92.7%。抗生素抗性测试结果表明，MK0901 对四环素、氨苄西林、环丙沙星、头孢曲松、克林霉素、克拉霉素、氯霉素均表现为敏感，仅对庆大霉素表现为耐药。细胞黏附性结果显示，MK0901 对HT-29的黏附率达到87.5%。此外，MK0901对大肠杆菌、沙门氏菌和金色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有一定抑制作用（表1）。综上，唾液乳杆菌MK0901 具有良好的安全性和体外益生特性，具备益生菌开发潜力。

3.2 MK0901对小鼠结肠炎的作用

3.2.1 小鼠体重及免疫器官指数测定结果 经DSS 溶液处理的3 组小鼠平均体重均低于CK 组，尤其是DSS 组，平均体重最低。至恢复期结束（第16 天），MK0901 组和LGG 组的平均体重均比DSS 组高。MK0901 组和LGG 组的平均脾脏指数比DSS 组低，与CK 组相近，但并无统计学差异（P＞0.05）（表2）。

表2 各组小鼠的平均体重和脾脏指数对比Table 2 Comparison of average body weight and spleen index of mice in each group

3.2.2 小鼠结肠组织病理学变化 组织切片显示，CK 组肠黏膜组织完整，未见溃疡，黏膜可见淋巴滤泡形成（图1：a）；DSS组结肠黏膜及肌层变薄，腺体层次减少，肠腔扩张，局部溃疡形成，表面未见腺上皮被覆，其下出血及小血管增生（图1：b）；与CK 组相比，LGG 组（图1：c）和MK0901 组（图1：d）的黏膜和肌层稍变薄，腺体层次减少，肠腔扩张，但较DSS 组而言，未出现明显溃疡，黏膜仅见少许慢性炎症细胞浸润。

图1 小鼠结肠HE染色图（×400）Fig.1 HE staining diagram of mouse colon （×400）

3.2.3 MK0901 对小鼠血清炎症因子水平的影响 与CK 组相比，DSS 组的3 种炎症因子水平都显著（IL-1β：P＜0.05）或极显著升高（TNF-α和IL-6：P＜0.01），而LGG 组和MK0901 组的均有所下降，其中，TNF-α 水平的差异不显著。MK0901 组与LGG 组的TNF-α 和IL-6 水平均极显著低于DSS 组（P＜0.01），但MK0901 组的IL-1β 水平与CK 组的差异不显著（P＞0.05）（图2）。

图2 小鼠炎症因子水平Fig.2 Levels of inflammatory factors in mice

3.2.4 MK0901 对结肠炎小鼠肠道菌群的影响MK0901 组的Shannon 指数最高；LGG 组的Ace 和Chao 指数最高；3 个多样性指数均是DSS 组最低（图3：A～C）。OTU 聚类结果显示，4 组样品的OTU数目为513～617 个，其中，DSS 组的最少（513），MK0901 组的最多（617）；4 组特有的OTU 数目为115～174个，其中，MK0901组最丰富（图3：D）。

图3 各组样品的菌群结构差异Fig.3 Bacterial structure difference of samples from each group

主坐标分析（PCoA）显示，PC1 与PC2 之和达53.98%（＞50%），DSS 组的菌群结构与其余3 组的差异最大，而LGG 组和MK0901 组则趋近于CK 组（图3：E）。

物种堆积图显示，在门水平上，拟杆菌门Bacteroidota和厚壁菌门Firmicutes是各组主要菌群门类。DSS 组中，拟杆菌门占据明显优势（P=70.98%），而厚壁菌门的比例最低（P=25.24%）（图3：F）。在属水平上，各组优势的前2 个属均为乳杆菌属Lactobacillus和隶属于Muribaculaceae 的某属。除CK 组外，其余组均包含较高比例的拟杆菌属Bacteroides，尤其是DSS 组，比例达到16.34%。与其他组相比，MK0901组含较多的毛螺旋菌科Lachnospiraceae和普雷沃氏菌科Prevotellaceae 成员，丰度分别为7.41%和5.45%（图3：G）。

4 讨论

作为抗生素替代品，益生菌近年来在人类和动物健康领域引起了广泛关注，其被认为拥有提高免疫力、缓解炎症、增加营养物质及调整肠道菌群等功效。安全性是筛选益生菌的重要指标，不具备溶血活性及对常见抗生素类型敏感是益生菌可服用的前提（冯程程等，2022）。当益生菌进入宿主体内后，会遭遇胃肠液环境中的高酸和高浓度胆盐胁迫，极有可能失去活性，因此，具备良好的胃肠环境耐受性才可保证益生菌发挥其益生性能。作为外源性细菌，益生菌对宿主肠道上皮细胞要有一定的黏附能力，才能定植于机体，进而调节微生态环境，并抵抗致病菌的侵袭（魏雪等，2022）。本研究显示唾液乳杆菌MK0901 在以上评估中均表现良好，还对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌等常见的肠道致病菌具有抑菌活性，展示了良好的安全性和益生特性。

MK0901 对结肠炎动物模型也显示出良好的修复活性。灌胃MK0901 有助于结肠炎小鼠恢复体重，恢复效果与公认的益生菌株LGG 的效果相当。脾是机体重要的免疫器官（吴涛等，2022），脾肿大则脾脏指数上升，表明存在炎症反应。虽然MK0901 组和LGG 组小鼠的脾脏指数与DSS 模型组的差异不显著，但DSS 组的平均脾脏指数高于MK0901 组和LGG 组，表明2 个菌株都具有一定缓解脾脏肿大的功效。结肠病理组织切片显示，MK0901 和LGG 菌在一定程度上保护了肠道组织，抵抗了DSS对结肠组织结构产生的损害作用，降低了溃疡和炎症的程度。促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 是检测机体免疫状态和炎症反应的重要指标（李青松等，2022）。益生菌可通过抑制炎症信号通路，从而降低促炎因子的表达量（齐从虎，杨景玉，2017；王吕斌，钱军，2019；Liet al.，2021）。本研究也发现MK0901 与LGG 对3 种促炎因子均具可极显著降低TNF-α 和IL-6 水平，而对IL-1β 水平的降低作用不明显，同时发现MK0901 降低IL-1β炎症因子的效果要优于LGG菌株。

肠道菌群多样性和组成的变化与结肠炎等肠道疾病关系密切。4组小鼠粪便微生物的16S rRNA测序分析显示，MK0901 组的Shannon 指数最高，LGG 组的Ace 和Chao 指数最高，表明灌胃益生菌可缓解由DSS 造成的肠道菌群多样性的下降。从肠道微生物组成上，MK0901 组具有最高的菌群总数及最多的独有菌群，这与其最高Shannon指数的结果一致。PCoA 显示MK0901 组与LGG 组与空白对照组的菌群组成更加相似，而DSS组则表现出较大差异，这表明2株益生菌都可调节宿主肠道微生物结构，使之恢复正常。莫晓玮等（2022）研究显示，拟杆菌属的丰度能反映结肠炎的严重程度，且两者呈正相关。这与本研究结果一致，DSS模型组拟杆菌属相对丰度高于CK 组，而MK0901 组和LGG组介于CK 组与DSS 组之间，表明2株益生菌都能缓解肠炎症状。此外，MK0901 处理后使毛螺旋菌科和普雷沃氏菌科细菌丰度增加。毛螺旋菌科具有水解糖和产生短链脂肪酸的作用，而短链脂肪酸在维持和修复肠道黏膜结构、保障肠道功能正常运作及防止炎症和溃疡发生等方面发挥着关键作用（杨立娜等，2022）。普雷沃氏菌科下的诸多成员被认为具有重要的营养功能，其能降解蛋白质和碳水化合物，并在一定程度上改善肠道微环境（Asgharianet al.，2022）。

唾液乳杆菌MK0901 显示出优良的体外益生特性，同时针对患结肠炎动物，该菌株具有维持体重、降低炎症水平、保护肠道组织及调节肠道菌群结构等功效，是非常具有开发潜力的益生菌候选菌株，为防治圈养猕猴由炎症性肠病引起的慢性腹泻提供了一个潜在的解决方案。

致谢：感谢四川大学生命科学学院张修月教授对本研究的支持和帮助，感谢益生菌团队成员杨宇、黄飞云、李嘉伟、夏雪及郑苗苗等对实验实施的帮助。