白僵菌产酶特性及应用研究现状

段先莉 贾子民 许炎芬 龙同 王砚妮 李文静 赵锦芳

摘要：白僵菌属是一类重要的真菌，球孢白僵菌为该属典型虫生真菌，因其寄主范围广、适应性强、致病性高、对环境无污染的特点，成为农林害虫生物防治中应用最广泛的虫生真菌之一。本文综述了白僵菌的致病机理、产酶特性及其应用方面的研究进展，旨在为白僵菌的开发应用提供一定参考。

关键词：白僵菌；球孢白僵菌；酶；生物防治

中图分类号：S476.12文献识别码：A文献编号：1005-6114（2023）02-013-06

1白僵菌的分类及侵染过程

1.1白僵菌的分类

白僵菌（Beauveria spp）的发现始于意大利学者Agostino Bassi，直到1912年被Vuillemin正式命名为白僵菌属［1］。白僵菌属自建立以来，对于种水平的分类没有统一的认识，甚至存在很大的分歧。传统的分类是以分生孢子和产孢结构作为分类的依据，主要为分生孢子、分生孢子梗、产孢轴、产孢细胞的形状和大小以及菌落的形态。截至2018年初，全球报道的白僵菌已有18种，其中我国发现了4种白僵菌，分别是球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）、多形白僵菌（Beauveria amorpha）和苏格兰白僵菌（Beauveria caledonica）。其中球孢白僵菌和布氏白僵菌是重要的应用于害虫生物防治的虫生真菌。

1.2球孢白僵菌的侵染过程

球孢白僵菌可以通过昆虫体壁、消化道、气管和伤口侵入虫体。最初分生孢子附着于虫体表面；在适宜的温度与湿度下，分生孢子萌发；随后对虫体角质层产生机械压力，白僵菌产酶溶解表皮并进入体内；菌丝繁殖并进入虫体的血淋巴产生菌丝体，其次级代谢产物破坏虫体的生理过程［2-3］，攻击宿主的防御系统，然后开始旺盛地生长，最终导致虫体的死亡，随后菌丝穿出表皮产生分生孢子并扩散［4］。刘忱等以玉米螟为研究对象，用电镜观察了白僵菌在虫体内的生长循环：接种白僵菌24 h后，分生孢子萌发并侵入昆虫体内，它们可以穿透体壁，进入体腔，进行普遍感染；接种48 h后，菌丝侵入血腔，出芽繁殖，直至腔体内充满菌丝，再突出体表向外生长；接种72 h后大量菌丝相互缠绕，覆盖虫体，同时存在菌丝消解现象，部分菌丝只剩空腔［5］。

2球孢白僵菌侵染过程诱导产酶特性2.1细胞壁降解酶

球孢白僵菌感染虫體时，孢子附着在昆虫表皮上形成附生菌。附生菌首先产生脂肪酶，脂肪酶水解虫体体壁内脂蛋白、脂肪和蜡的酯键，促进孢子渗透虫体角质层［6］。研究表明，脂肪酶通过增加真菌和角质层表面之间的疏水相互作用来支持发芽孢子与昆虫角质层的粘附［3］。此外，脂肪酶的作用不仅消除了孢子入侵的屏障，其降解昆虫的表皮成分也可为白僵菌的萌发提供营养物质［6］。

其次附生菌产生蛋白酶。蛋白酶在感染过程中起着双重作用。蛋白酶主要功能是水解表皮蛋白，但在昆虫表皮中抗真菌蛋白的失活中也发挥作用［3］。蛋白酶的底物为类枯草杆菌蛋白酶（Prl）和丝氨酸类胰蛋白酶（Pr2）。Pr1具有重要意义，其基因的表达产物能够引起虫体免疫系统的紊乱，并激活虫体内多酚氧化酶系发生氧化反应，最终导致虫体中毒死亡。Pr2的作用机理尚不明，需要进一步研究，猜测为Pr2对Pr1可能存在诱导作用，能调节Pr1产生的快慢［7］。

最后附生菌产生的酶是几丁质酶，可水解由β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖组成的甲壳素线性聚合物（几丁质）。几丁质酶根据对几丁质分子的作用位置分为内切几丁质酶（水解几丁质分子内的β-1，4-糖苷键）和外切几丁质酶（水解内切几丁质酶作用形成的N-乙酰谷氨酸-可溶性寡聚体）。昆虫几丁质的完全降解需要内切酶和外切酶的联合作用［3］。

2.2核毒素

白僵菌在抑制虫体的免疫力时会分泌核毒素（Rib）。核毒素是细胞外分泌的核糖核酸酶（RNase），可使生物体的核糖体失活。核糖核酸酶通过切割核糖体sarcin/ricin loop（SRL）的单个磷酸二酯键，导致核糖体完全失活，并因细胞凋亡而死亡。Rib通过抑制宿主的免疫力、阻断宿主翻译而促进感染，有助于白僵菌的致病性。Yi Yuan等发现Rib基因的缺失会导致感染过程中毒力的减弱；将Rib进行重组纯化后与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌共同注射可以显著增强细菌的致病性［8］。白僵菌核毒素是抑制虫体免疫的关键毒力因子。现阶段对于核毒素是如何进入昆虫宿主细胞以及对真菌本身是否会有不利影响、真菌如何保护自己的核糖体难以确定，需要进一步的研究证实。

2.3虫体解毒和防御相关酶

昆虫在受到白僵菌或其他真菌感染时，会触发自身的防御和解毒机制。谷胱肽硫转移酶（GST）、乙酰胆碱脂酶（AChE）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）是此过程中最常见的酶［9］。GST在对氧化应激的解毒和细胞抗氧化防御中起着关键作用，它与天然和合成的外源性异生物素的亲电中心结合；AChE是一种丝氨酸水解酶，通过参与乙酰胆碱（神经递质）的快速水解终止神经冲动；CAT通过参与H2O2的清除来保护宿主免受氧化损伤；SOD可以迅速上调以应对外来生物的威胁。昆虫以上酶活性的变化受感染真菌的影响。

白僵菌孢子与植物醇联合使用感染宿主，感染前期时宿主的GST、CAT、SOD活性增加，AChE与处理浓度呈反比关系。感染后期四种酶的活性降低。绿僵菌与杀虫剂联合使用感染宿主：感染初期各种酶的活性增加，后期活性降低。昆虫体内酶的变化破坏了内环境的稳定［10-12］。了解每种酶单独或组合的响应规律和活性将为设计新颖且更有效的害虫防治手段提供帮助。

球孢白僵菌Gas3β-葡糖基转移酶有助于真菌适应极端碱性条件。真菌β-1，3-葡萄糖基转移酶是一种与胁迫反应、细胞壁完整性和毒力有关的细胞壁重塑酶［13］。聚酮化合物合酶BbpksP的产物有助于增加白僵菌分生孢子细胞壁的完整性、紫外线耐受性和杀虫活性［3］。

2.4海藻糖酶

昆虫体内的能量物质主要以海藻糖（trehalose）的形式贮存，海藻糖是一种非还原性的二糖，能提供昆虫摄食、寻偶、迁飞等生命活动所需的能量，同时也是一种重要的压力保护剂，可帮助昆虫抵抗非生物胁迫，包括氧化、高渗透压、营养饥饿等［6］。病原真菌在虫体内能利用的糖类物质主要是葡萄糖，因此，病菌需要将海藻糖转化为葡萄糖才能吸收利用。病原真菌分泌海藻糖酶的能力越强，其对虫体内海藻糖的水解和转化速度就越快，越有利于病原真菌的繁殖和感染，同时也能破坏昆虫体内的血糖平衡，加速昆虫的死亡［3］。

白僵菌产生酸性海藻糖酶，是多数真菌利用胞外海藻糖的主要酶类，其水解海藻糖转变成葡萄糖分子，为白僵菌提供营养。白僵菌海藻糖酶不直接参与角质层的消化，但其活性可作为反映菌种致病力的一个重要因子［3］。

3白僵菌的应用

3.1害虫生物防治

球孢白僵菌因宿主范围广、致病性强、适应性强、针对性强、使用方便、无污染等特点被广泛用于农林害虫的生物防治。白僵菌最初的使用是由绿僵菌防治奥地利金龟子引发的，随后开始用于防治松毛虫、蚜虫和粉虱。郑惠成研究发现，白僵菌可有效防治油桐鹰尺蠖，且白僵菌对鹰尺蠖的杀虫活性与高剂量的灭多虫和氯氰菊酯相当［14］。

随着对生物防治剂了解的不断深入，研究者不再把目光集中在单独使用某种药剂上，开始研究不同生物防治剂、生物防治剂与化学物质的联合使用。但是联合使用会表现出不同的相互作用，如协同、拮抗作用等。白僵菌与管氏肿腿蜂的联合使用能有效地控制桑天牛，两者的结合使用比单一的使用有更高的致病力，但是，白僵菌和管氏肿腿蜂之间还存在共同宿主的竞争关系，两者竞争食物来源，目前关于如何调节协同或拮抗关系的机制还不清楚，有待进一步研究。在绿僵菌与杀虫剂的联合使用中，合适的比例能有效增加飞蝗的死亡率，当杀虫剂的比例过大时就会产生拮抗作用［12］。Ahmed Mohammed AlJabr等在研究白僵菌孢子与植物醇的联合使用时发现，拮抗作用的出现可能是白僵菌孢子粉比例较高所致［11］。将植物醇和白僵菌孢子粉调整至合适的配比后混合使用，能产生极强的协同杀螨作用，同时还能降低虫体抗药性。白僵菌作为生物农药单用或者与其他措施联合使用在实际生产应用中会受到温度和湿度等因素的影响［15-16］。近年来，全球变暖影响白僵菌的防治效果，因此筛选具有耐热性能的球孢白僵菌菌株是目前普遍关注的研究方向。

3.2植物內生菌

在所有微生物中，植物内生真菌广受关注。它们使植物具有更好的性能，增强植物对生物和非生物胁迫的抗性。如白僵菌接种到玉米种子中作为内生菌，可改善玉米植物的开花时间和耐旱性；内生白僵菌能够提高红橡树苗的抗旱能力，并且能刺激根的生长［17-19］。

3.3发酵产酶

Alves等2020年发现白僵菌的细胞壁降解酶具有高特异性、高稳定性、高效、安全性及环境友好的特点［20］。可对白僵菌进行固态发酵产酶、然后用超滤膜进行酶浓缩，但是该技术存在的问题是发酵期间酶产量低。

几丁质酶可以用于真菌原生质体的分离、生物活性壳聚糖的制备、壳回收物中的寡糖以及单细胞蛋白的生产，具有免疫机能活化、抑制癌症及高血压、镇痛止血除菌等特性，在医药、化妆品、食品、农业害虫防治等方面都有应用。Elawati等研究了白僵菌产几丁质酶的活性，发现几丁质酶的含量随着发酵时间的增加而增加，在对数期时产酶量最佳［21］。张嘉铖等在大肠杆菌中实现白僵菌几丁质酶基因的高效表达，使几丁质酶的产量大大提高［22］。Andrea Lovera等发现，重组几丁质酶明显增强了白僵菌分生孢子对小蔗螟的毒力，300 g/mL的重组几丁质酶使得白僵菌的杀虫效率达到96.7%（感染后14 d）［23］。

脂肪酶水解三酰基甘油的酯键，从而释放出游离脂肪酸、二酰基甘油、单酰基甘油和甘油。Enrico Cerioni Spiropulos Gonalves等选择白僵菌作为生产脂肪酶的菌株，然后在构巢曲霉中表达，并调节碳源以增强重组脂肪酶的分泌，以固定化手段增强脂肪酶的催化，成功地从常见的食物残渣中获得生物柴油［24］。生物柴油更加清洁、更高的含氧量、低含硫量，而且具有高度的生物降解性和无毒性。Malena Martínez Pérez等选用白僵菌产脂肪酶，然后用脂肪酶生产油酸和亚油酸［25］。

3.4生物催化剂

R-2-（4-羟基苯氧基）丙酸（R-HPPA）是合成芳氧苯氧丙酸除草剂的关键手性中间体。R-HPPA可通过化学法、生物学法获得。化学法的成本高昂、获得率低限制了工业应用的发展。生物学法中的全细胞催化法比过氧化物酶催化法更易操作、对映选择高。为了获得更高产量的R-HPPA，可将深层发酵改为固态发酵［26］。因为固态发酵不仅提高产量、改善产品特性，而且无大量废水产生、无机械能消耗。研究数据显示，使用固态发酵R-HPPA的获得率可达到77.78%，相比于深层发酵提高了15.14%。Hu Hai-feng等人的研究结果显示，通过联合诱变可提高R-HPPA的产量，而且经过诱变后的白僵菌菌株具有更好的底物耐受性［27］。为了改进球孢白僵菌的R-HPPA生物合成，Zhou Hai-Yan等提出并优化了一种基于氧化剂重铬酸钾与R-HPPA产物显色反应的高通量筛选方法［28］。

具有6、19-环氧乙烷桥的类固醇化合物具有抗惊厥和止痛特性，而且可以抑制革兰氏阳性细菌活性和选择性的抗谷氨酸皮质类固醇激素作用。白僵菌经过生物转化能获得此类固醇新的衍生物［29］。

球孢白僵菌对黄酮类化合物具有O-甲基糖基化作用。Penso等利用球孢白僵菌B. bassianaATCC 7159催化柚皮素和槲皮素糖基化生物合成7-β-O-糖苷。所生成的柚皮素-7-β-O-糖苷和槲皮素-7-β-O-糖苷也具有增加毛细血管的张力，降低血管紧张度的特性。但是，与柚皮素和槲皮素相比，两种糖苷降低血管舒张度的效果存在差异，推测可能存在不同的作用途径［29］。

3.5抗肿瘤作用

真菌多糖是真菌中的有效生物活性成分，能够增强机体的免疫功能，并在抗肿瘤方面发挥积极作用。宋志强使用不同浓度的白僵菌多糖溶液分别刺激B淋巴细胞和小鼠肠癌细胞，结果发现白僵菌多糖对B淋巴细胞有增殖作用，对小鼠肠癌细胞具有抑制作用，说明白僵菌多糖具有保护机体的作用，但是免疫机制与肿瘤机制需要进一步研究［30］。白僵菌素和球孢交酯对肿瘤细胞具有强大的细胞毒性作用，能抑制结核分枝杆菌或恶性疟原虫的活性，并限制胆固醇酰基转移酶抑制剂的活性［3］。Kim，Ki Hyun利用白僵菌分离得到了两种新的差向异构体磷丙二酮聚酮化合物，具有亚甲基桥连间苯三酚骨架和高度重排的支架；此外，首次从天然来源中分离出两个苯丙二酮的二聚体，beauvetetraone C，研究发现beauvetetraones A-C对人体乳腺癌细胞表现出较弱的细胞毒性［31］。

白僵菌侵入虫体后，造成死亡的僵化虫体——白僵蚕，具有许多活性成分。如蛋白质、维生素、酶、氨基酸、微量元素、有机酸、草酸铵、白僵菌素等活性成分，具有抑癌、抗惊厥、抗肿瘤作用。僵蚕中富含蛋白质的提取物（BBPs）在体外具有潜在的抗癫痫作用［32］。该发现对开发用于治疗癫痫的新药有一定的帮助。僵蚕对肝细胞癌的作用主要与肿瘤的微环境有关，它通过调节巨噬细胞M1发挥抗癌作用。目前对于抗癌作用的研究集中在僵蚕的单一疗法，未来可以结合中、西药研究其作用机理［33］。僵蚕乙醇提取物（BBE）对胃癌、宫颈癌细胞具有凋亡作用，且该作用与基因调控具有相关性，如bcl-2和bax等。BBE的促凋亡活性与其调控Bcl-2和Bax基因表达的能力有关［34-35］。这说明僵蚕乙醇提取物在抗癌抗肿瘤方面具有潜在价值。但是在使用僵蚕做药时要考虑安全性问题，需要进一步确认僵蚕中的成分是否有毒性。

3.6抗蒸腾剂

甘草是医药、食品和化妆品的原料，多分布于干旱和半干旱的荒漠草原、沙漠边缘、黄土丘陵地区。水分是甘草在生长过程中的重要影响因素，植物体吸收的水分大部分都通过气孔散失到大气中。在研究微生物诱导的气孔开闭运动时发现白僵菌可以诱导甘草的气孔关闭，白僵菌的施用时间与气孔开度之间有明显的正相关关系，在处理时间为2 h时，气孔开度最小［36］。

4总结与展望

生物防治在农作物病虫害绿色防控与“农药减施”方面发挥了十分重要的作用，部分白僵菌属真菌具有重要的生防应用价值，但在生产实践中，白僵菌属真菌如球孢白僵菌的防治效果会因高温、干燥或者阳光照射等不利环境因素的影响而大大降低，因此需要研究如何提高白僵菌对环境的耐受性。此外，当前白僵菌的研究已逐渐向多学科方向发展，如临床医学、林学、酶工业等方面，特别是白僵菌次级代谢产物对肿瘤的抑制具有潜在的价值。白僵菌发展潜力巨大，有待深入开展相关理论与应用研究。

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