广西酸笋微生物多样性分析及其乳酸菌的特性研究

钟源 张雅雯 吕健曼 陈美霖 马华威 郭爱玲 唐丹萍

摘要：为开发广西酸笋的纯种发酵工艺，需要筛选出具有较强亚硝酸盐降解能力以及高产GABA（γ-氨基丁酸）能力的乳酸菌。该研究首先对广西柳州不同厂家的酸笋进行微生物多样性分析，结果表明乳杆菌属（Lactobacillus sp.）为广西酸笋中的主要优势菌属。对筛选出的乳酸菌特性进行研究，结果显示菌株R9和R25降解亚硝酸盐的能力最强，降解率分别可达到（99.92±0.13）%和（99.03±0.66）%；菌株R22产生的GABA含量最高，为（71.77±3.35） μg/mL。对菌株L29、R9、R19、R22、R25进行耐受性研究，结果表明菌株R9、R19、R25对NaCl浓度≤7%、胆盐浓度≤0.7%、pH 3.5和pH 4有较强的耐受性，因此选择乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）R9、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）R19和R25作为后续酸笋纯种发酵试验菌株。

关键词：酸笋；乳酸菌；微生物多样性；亚硝酸盐；GABA

中图分类号：TS255.3      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）05-0001-09

Abstract： In order to develop the pure breed fermentation process of Guangxi sour bamboo shoots， it is necessary to screen lactic acid bacteria with strong nitrite degradation ability and high GABA （γ-aminobutyric acid） production ability. In this study， the microbial diversity of sour bamboo shoots from different factories in Liuzhou， Guangxi is analyzed firstly， and the results show that Lactobacillus sp. is the main dominant genus of Guangxi sour bamboo shoots. The characteristics of the selected lactic acid bacteria are studied， the results show that strains R9 and R25 have the strongest ability to degrade nitrite， and the degradation rates could reach （99.92±0.13）% and （99.03±0.66）% respectively. Strain R22 produces the highest content of GABA， which is （71.77±3.35） μg/mL. The tolerance of strains L29， R9， R19， R22 and R25 is studied， and the results show that strains R9， R19 and R25 have strong torlerance to NaCl concentration≤7%， bile salt concentration≤0.7%， pH 3.5 and pH 4. Therefore， Pediococcus acidilactici R9， Lactobacillus plantarum R19 and R25 are selected as the subsequent pure breed fermentation experimental strains of sour bamboo shoots.

Key words： sour bamboo shoot; lactic acid bacteria; microbial diversity; nitrite; GABA

收稿日期：2022-11-20

基金項目：中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（2262019PY067）

作者简介：钟源（1996－），男，硕士，研究方向：食品加工与安全。

*通信作者：唐丹萍（1977－），女，高级畜牧师，研究方向：畜牧水产品加工。

新鲜竹笋中水分含量高[1]，氨基酸含量丰富[2]，但保藏期短，易腐烂，因此将其制成发酵酸笋，既能延长保藏期，又能使其风味更加独特。现行的广西酸笋传统发酵方法多是以麻竹笋或甜笋为原料，将其切成丝状或片状后，加入井水或山泉水，在密封厌氧条件下利用原料自身的微生物发酵而成[3-4]。然而酸笋自然发酵过程中微生物菌群复杂多变，发酵周期长[5]，且存在亚硝酸盐超标等问题[6]，因此将酸笋发酵方式由自然发酵向纯种发酵转变成为当前的研究热点。

研究人工纯种发酵方法，需要对自然发酵酸笋中的微生物菌群进行分析，并从中筛选出具有特定功能的菌株来进行发酵研究。利用Illumina NovaSeq测序平台进行高通量测序，能够较为全面地对样品中的微生物菌群进行分析，谷晓东等[7]对6种黄酒酒曲进行微生物多样性分析，发现在黄酒酒曲中有多种真菌及细菌共同作用；刘丽宅等[8]对延边传统发酵泡菜进行高通量测序，结果表明泡菜中有3种细菌优势菌属和4种真菌优势菌属。因此，本研究同样选择高通量测序技术对自然发酵酸笋进行菌群多样性研究。

本研究的目的是筛选出可用于纯种发酵的菌株，从而降低酸笋在发酵过程中产生的亚硝酸盐，增加益生物质GABA，提高酸笋的食用价值和营养价值。因此，本文将同时选取具有较强亚硝酸盐降解能力和高产GABA能力的乳酸菌菌株，并对其耐受性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

酸笋：选自广西省柳州市3家不同工厂生产的自然发酵酸笋。

1.2 试剂

MRS琼脂/肉汤培养基、MC琼脂培养基、LB营养琼脂/肉汤培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂糖：基因科技（上海）股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker Ⅲ、6×Loading Buffer：北京庄盟国际生物基因科技有限公司；GoldenView核酸染料：北京艾德莱生物科技有限公司；引物27f、引物1492r：生工生物工程（上海）股份有限公司；FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit试剂盒：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；亞硝酸钠标准溶液、γ-氨基丁酸标品：上海源叶生物科技有限公司；重蒸酚、革兰氏染色试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；碳酸钙、过氧化氢、氯化钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、四硼酸钠、次氯酸钠、正丁醇、无水乙醇、冰醋酸、盐酸、猪胆盐、乳酸：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器与设备

D247LE-32超净工作台 利安捷CHNT公司；JE502电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；SHP-250型生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 合肥华泰医疗设备有限公司；QL-901涡旋振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；13395H2X光学显微镜 徕卡显微系统（上海）有限公司；5415-R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；HH-2恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；超微量分光光度计 联想生物科技有限公司；XP基因扩增仪 杭州博日科技有限公司；DYY-8C型电泳仪 北京六一仪器厂；蓝光切胶仪 莫纳生物科技有限公司；隔膜真空泵 天津市津腾实验设备有限公司；721G可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；Multiskan FC酶标仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 酸笋微生物多样性分析

将3种酸笋样品分别混匀，每种酸笋取两个样品，分别编号为SS11、SS12、SS21、SS22、SS31、SS32，按照固液比1∶1的比例将样品装入无菌带盖离心管中，在－80 ℃冰箱中冷冻后破碎离心。将样品进行DNA提取及高通量测序。

1.4.2 乳酸菌的分离纯化

将酸笋发酵液用生理盐水进行梯度稀释，取合适稀释度的样品液分别涂布于MC琼脂培养基和含有1.5% CaCO2的MRS琼脂培养基中培养48 h。挑选在两种培养基上有溶钙圈的单菌落在MRS平板上进行划线，直至分离纯化。纯化后的菌株进行革兰氏染色及过氧化氢酶实验，将菌株在MRS液体培养基中培养24 h，将发酵液保存在40%的甘油管中，置于－80 ℃冰箱中保藏备用。

1.4.3 乳酸菌的分子生物学鉴定

挑选1.4.2中呈革兰氏阳性、过氧化氢酶呈阴性且在MRS液体培养基中生长良好的菌株，用FastPure Bacteria DNA Isolation Mini Kit试剂盒提取各个菌株DNA，用Nanophotometer N60微量分光光度计检测DNA浓度。以提取的DNA为模板，选取细菌16S rDNA基因的通用引物27f、1492r进行PCR扩增。正向引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492r（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环32次；72 ℃延伸10 min。扩增后的PCR产物利用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并送至北京擎科生物科技有限公司进行测序，将测序结果在NCBI上进行比对。

1.4.4 乳酸菌的溶血性研究

将1.4.2中初筛的菌株接种到10 mL MRS肉汤培养基中，在37 ℃下培养24 h，将菌液在血琼脂平板培养基上划线，于37 ℃下培养24 h后观察菌落生长状况。

1.4.5 乳酸菌降解亚硝酸盐能力研究

取冻存菌液100 μL活化两代，活化后的菌液按照2%（体积比）接种量接种到含100 mg/L NaNO2的MRS肉汤培养基中，于37 ℃下培养24 h后测定培养液中NaNO2的含量，以同体积蒸馏水代替离心上清液作零管调零。NaNO2测定方法及标准曲线的制作方法参照GB 5009.33－2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法。亚硝酸盐标准曲线横坐标为亚硝酸盐含量，纵坐标为538 nm处的吸光度值，回归方程为y=0.015x+0.001 7，相关系数R2=0.999 3，拟合度较高，可用于后续测定。亚硝酸盐降解率计算公式为：

M=C1-C2C1×100%。

式中：M为亚硝酸盐降解率（%）；C1为MRS肉汤培养基中初始NaNO2的质量浓度（mg/L）；C2为MRS肉汤培养基中残余NaNO2的质量浓度（mg/L）。

1.4.6 乳酸菌产GABA能力研究

1.4.6.1 乳酸菌产GABA的定性分析

取冻存菌液100 μL活化两代，将活化后的菌液按2%（体积比）接种到含有10 g/L MSG的MRS肉汤培养基中，在37 ℃下培养24 h，将发酵液置于高速冷冻离心机中，在4 ℃，9 800×g下离心10 min，取上清液，用薄层色谱层析法（TLC）初筛。采用正丁醇∶冰醋酸∶超纯水（4∶1∶1）作为展开剂[9]，待展开结束后使用三角喷瓶在层析板上覆盖0.5%茚三酮-乙醇溶液，在85 ℃下烘干15 min直至溶剂完全挥发，条带显现。以GABA标准溶液作为对照，观察样品条带是否有与标准溶液比移动值（Rf）相同的斑点。

1.4.6.2 乳酸菌产GABA的定量分析

根据肖君荣[10]的方法，稍作修改。取培养24 h的菌液离心上清液600 μL，加入0.1 mol/L四硼酸钠缓冲液2 mL和800 μL 6%（体积比）的重蒸酚溶液混匀，再加入10%次氯酸钠溶液900 μL，振荡混匀，将溶液置于沸水中水浴10 min，然后冰浴20 min至溶液出现蓝绿色，加入4 mL 60%乙醇溶液振荡均匀。静置后于645 nm波长处测定吸光度值，以同体积蒸馏水代替离心上清液作零管调零。

GABA 的标准曲线以 GABA 浓度为横坐标，645 nm处的吸光度值为纵坐标，得线性方程 y=0.345 1x－0.006 1，相关系数 R2=0.999 7，适用于GABA含量的测定。

1.4.7 菌株耐受性研究

1.4.7.1 菌株耐受NaCl研究

将待测菌株活化后重悬，按照梯度稀释，调整菌液浓度至1×109 CFU/mL。将上述菌悬液按照2%接种量分别加入到含有0%、1%、3%、5%、7%、9%、11% NaCl的MRS肉汤培养基中，在37 ℃下培养24 h，分别于0 h和24 h取样测定OD600nm值。

1.4.7.2 菌株耐酸研究

将待测菌株菌悬液按照2%接种量分别加入到pH 为 4，3.5，3，2.5的MRS肉汤培养基中，在37 ℃下培养20 h，分别于0，2，4，6，8 h取样测定OD600nm值，并于20 h取样，涂布于MRS琼脂培养基中，于37 ℃培养48 h，观察菌株生长状况。

1.4.7.3 菌株耐受胆盐研究

将待测菌株菌悬液按照2%接种量分别加入到含有0.1%、0.3%、0.5%、0.7%猪胆盐的MRS肉汤培养基中，在37 ℃下培养20 h，分别于0，2，4，6，8 h取样测定OD600nm值，并于20 h取样，涂布于MRS琼脂培养基中，于37 ℃培养48 h，观察菌株生长状况。

1.4.8 数据统计与分析

本研究使用IBM SPSS Statistics 26软件进行数据处理，使用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 酸笋中微生物多样性分析

2.1.1 OTU聚类和稀释曲线分析

OTU即分类操作单元，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系、种、属、分组等）设置的同一标志。通过对6组酸笋样品的16S rDNA进行高通量测序，将得到的原始序列进行高质量序列拼接、过滤长度和嵌合体后，共获得471 920条有效序列，使用Usearch软件[11]对Reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得OTU。各组样品OTU个数见表1，其中SS2组酸笋样品的OTU数目多于SS1组和SS3组，为353和357。

样品稀释曲线见图1。

由图1可知，当样本序列在0～10 000之间时，除SS11组样品外，其余组OTU数目均呈指数性增长，在样本序列为10 000～70 000之间时，OTU数目增长趋势平稳，表明测序已趋于饱和，当前测序结果足以反映样本中的微生物多样性。

2.1.2 不同酸笋微生物的Alpha多样性分析

ACE指数和Chao1指数反映细菌群落丰度，Simpson指数和Shannon指数则用于比较群落多样性。不同样品微生物多样性指数见表2。

由表2可知，样品的ACE指数在286.56～365.99之间，Chao1指数在273.46～380.27之间，Simpson指数在0.46～0.83之间，Shannon指数在2.00～4.23之间，覆盖率范围为99.92%～99.98%。其中SS21和SS22的ACE指数和Chao1指数相对较高，表明该组细菌群落丰度更高，SS12的Simpson指数和Shannon指数更高，表明该组群落结构较复杂。试验样品的覆盖率较高，表明此次测序结果基本可以代表样品的实际情况。

随着测序量的增加，发现的物种增多，但是Shannon曲线却趋于平稳，说明直到物种饱和后，增加抽样条数也并不能发现新的特征，见图2。

2.1.3 不同酸笋微生物的细菌群落结构分析

酸笋样品的细菌群落结构见图3。

由图3中A可知，在门水平上共检测出10种丰度较高的细菌门类，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸桿菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、髌骨细菌门（Patescibacteria），其中SS1组和SS2组的厚壁菌门含量最多，分别为84.05%和48.42%，其次为蓝细菌门，占样品序列的25.31%；SS3组的蓝细菌门含量最多，占68.59%，其次为厚壁菌门，占比25.31%。由此可初步判断不同酸笋之间微生物群落在门水平上也各不相同，但主要优势菌门均为厚壁菌门和蓝细菌门。

由图3中B可知，在属水平上，SS1组的第一优势菌属为乳杆菌属（Lactobacillus sp.），占样品序列的77.09%，第二优势菌属为未培养叶绿体细菌属（Uncultured_Bacterium_o_Chloroplast sp.），占比为10.49%；SS2组和SS3组的第一优势菌属均为未培养叶绿体细菌属，占比分别为45.86%和68.59%，第二优势菌属则为乳杆菌属，占比分别为41.88%和18.61%。据报道，发酵蔬菜中的主要优势菌属为乳杆菌属、乳球菌属（Lactococcus sp.）、魏斯氏菌属（Weissella sp.）[12-13]和明串珠菌属（Leuconostoc sp.），此次测序发现的优势菌属与报道有重合部分。

2.2 乳酸菌的分离纯化

从广西柳州市3种不同的自然发酵酸笋中分离得到40株菌，将部分筛选出的菌株在MRS及MC平板上划线，菌落形态及革兰氏染色镜检形态见图4。

由图4中A和B可知，菌株为呈白色半透明的圆形菌落，表面光滑微凸。

由表3可知，经过进一步培养，初步鉴定40株菌株为乳酸菌，均为革兰氏阳性菌，其中R9为球菌，其余均为杆菌，过氧化氢酶试验均为阴性。

2.3 乳酸菌的分子生物学鉴定

对分离初筛得到的40株菌株进行分子生物学鉴定，部分菌株16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果见图5。

由图5可知，菌株在约1 500 bp处均有明亮清晰条带，将PCR扩增产物进行双向测序，测序结果经NCBI比对，结果见表4。

2.4 乳酸菌的溶血试验

为了后续研究的进行，需要对菌株进行生物安全性评估。菌株在血平板上的溶血性见图6。

由图6可知，试验菌株在血平板上菌落周围均未出现透明圈和绿色溶血圈，说明没有引起溶血现象，即均为γ-溶血，可以进行下一步的研究以及在后续酸笋发酵试验中应用。

2.5 菌株降解亚硝酸盐能力研究

亚硝酸盐是一种潜在致癌物质，当人体摄入过量时，在酸性条件下，亚硝酸盐与生物胺结合生成亚硝胺，亚硝胺具有强致癌性[14-15]，会诱发人体各个器官部位的癌变，如胃癌、肠癌、肝癌等[16-17]。亚硝酸盐在发酵蔬菜中的检出屡有报道，因此本文对筛选出的乳酸菌24 h降解亚硝酸盐能力进行了研究，结果见表5。

由表5可知，菌株R9的降解率最高，达到了（99.92±0.13）%，其次为R25，达到了（99.03±0.66）%。所以选取R9和R25菌株进行后续的耐受性试验。

2.6 菌株产GABA能力研究

GABA（γ-氨基丁酸）是一种由谷氨酸脱羧酶（GAD）产生的四碳自由氨基酸，广泛存在于微生物、植物和动物中，是目前食品领域重点研究的生物活性成分[18-19]。研究表明，GABA具有改善糖尿病[20]、降血压[21]、改善肾功能[22]及提高免疫力[23]等功效。利用乳酸菌增加酸笋中GABA的含量，提高酸笋营养价值，可以使酸笋产品更受大众喜爱，从而提高酸笋产品的经济价值。首先对菌株产GABA能力进行定性分析，经过薄层色谱法筛选后，有10株出现符合GABA标准品的红点，结果见图7中A。通过比色法对乳酸菌产生的GABA进行定量分析，结果见图7中B。由图7中B可知，菌株R22产生的GABA含量最高，为（71.77±3.35） μg/mL，其次为R25、R19和L29，分别为（61.14±2.90），（54.38±3.35），（49.55±2.90） μg/mL。因此选取L29、R19、R22、R25以及亚硝酸盐降解能力较强的R9 5株菌株进行后续的耐受性试验。

2.7 菌株耐受性研究

2.7.1 菌株耐NaCl研究

现今的广西酸笋以无盐发酵为主，为了后续调味型酸笋的研究，满足更多人群的需求，需要对所筛选菌株进行NaCl耐受性研究。5株菌株在含不同浓度NaCl的MRS肉汤培养基中培养24 h的生长情况见图8。

由图8可知，当培养基中NaCl浓度在3%以下时，所有菌株均可以生长；当浓度达到5%时，菌株R9、R19和R25的耐受性较好，菌株L29和R22的生长受到抑制；当浓度达到7%时，菌株L29和R22已基本不生长；当浓度为9%时，菌株R9的OD600 nm仍有0.347，说明此时菌株R9仍具有一定的耐受性；而当浓度达到11%时，所有菌株几乎都不生长。由此可知，菌株R19和R25对NaCl浓度在7%以下，菌株R9对NaCl浓度在9%以下时均具有一定的耐受性。

2.7.2 菌株的耐胆盐研究

胆盐（bile salt）是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而成的钠盐或钾盐，在小肠中的浓度约为0.3%。胆盐对细菌有一定的抑制作用，会降低乳酸菌在肠道中的存活力[24]，因此需要对筛选出的5株菌株进行胆盐耐受性研究。5株菌株对不同浓度胆盐的耐受性见图9。

由图9中A可知，5株菌株培养4 h后生长曲线均有上升，说明在0.1%胆盐浓度下各菌株均有一定的耐受性，L29稍差；由图9中B～D可知，胆盐浓度越大，菌株的8 h存活率随着时间的延长下降的趋势越明显。由图9中E可知，5株菌株在0.1%胆盐浓度下培养20 h后涂布于平板上均可生长，L29的生长状况较差，说明其胆盐耐受性较弱；当胆盐浓度在0.3%～0.7%时，L29在平板上已不生长，其余4株菌株仍可以长满平板；而胆盐浓度大于0.5%时，R9、R19和R25 3株菌的耐受性略有下降，但仍可存活生长。由此可知，菌株R9、R19、R22和R25在膽盐浓度为0.7%以下时均具有一定的耐受性。

2.7.3 菌株的耐酸研究

酸笋在发酵过程中，由于微生物的作用，pH值会逐渐降低，酸性环境对细菌也有一定的抑制作用，因此需要对筛选出的菌株进行耐酸研究。

由图10中A～D可知，5株菌株在2 h内的生长曲线下降缓慢，并且部分菌株有升高的现象，说明菌株在2 h内对酸性环境的耐受性较好；随着培养的进行，由于乳酸菌的产酸特性，培养基的pH值可能进一步降低，所以菌株在2 h后的生长曲线呈下降趋势。结合图10中E可知，当pH为4时，5株菌株在平板上均可生长；当pH为3.5时，R22已不再生长，L29生长受到抑制但仍具有一定耐受性，R9、R19和R25仍可长满平板，说明这3株菌的耐受性较好；当pH值在3.5以下时，所有菌株均不生长。由此可知，菌株L29、R9、R19和R25对pH 3.5和pH 4均具有一定的耐受性。

综上，根据菌株耐受性研究结果可知，菌株L29虽然可以耐受一定程度的酸性环境，但在较低浓度的NaCl和胆盐中的生长均受到抑制；菌株R22虽然可以耐受较高浓度的胆盐，但是对低浓度NaCl和pH≤3.5的酸性环境耐受性较差；菌株R9、R19和R25在较高浓度的NaCl和胆盐中仍具有较强的耐受性，并且在pH为3.5的酸性环境中仍可存活生长，因此选取R9、R19、R25 3株菌进行后续的纯种发酵研究。

3 结论

本研究通过对广西柳州不同厂家的酸笋进行微生物多样性分析，发现3家酸笋的菌群结构虽各不相同，但主要优势菌属均为乳杆菌属（Lactobacillus sp.）。对酸笋中的乳酸菌进行分离纯化，共筛选出40株具有乳酸菌特征的菌株，经过分子生物学鉴定，进一步确定其所属菌种。接着对初筛的40株乳酸菌的亚硝酸盐降解能力及产GABA能力进行研究，结果显示菌株R9和R25降解亚硝酸盐的能力最好，降解率分别可达到（99.92±0.13）%和（99.03±0.66）%；菌株R22产生的GABA含量最高，为（71.77±3.35） μg/mL，其次为R25、R19和L29，分别为（61.14±2.90），（54.38±3.35），（49.55±2.90） μg/mL。对上述5株菌株L29、R9、R19、R22、R25进行耐受性研究，结果表明菌株R9、R19、R25对NaCl浓度≤7%、胆盐浓度≤0.7%、pH 3.5和pH 4有较强的耐受性。选择乳酸片球菌R9、植物乳杆菌R19和R25作为酸笋纯种发酵菌株，在保留酸笋独特风味的基础上，研究出低亚硝酸盐且富含益生物质GABA的产品，既可以提高酸笋的食用价值和营养价值，又符合当前大健康的时代理念。

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