茶树ANR基因家族的全基因组鉴定与分析

段丽丽 李魁印

摘 要：花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）是原花青素生物合成途径中的关键酶之一，同时，ANR通过调节植物不同组织中花青素的积累影响植物对光的吸收程度和叶面温度，提高茶树的防御力和对环境的适应性。利用生物信息学分析方法，从‘舒茶早基因组数据中鉴定出茶树ANR基因家族成员，并分析ANR家族成员的基因结构、蛋白理化性质、保守基序及顺势作用元件。结果表明，CsANR家族有21个成员，分为7类，含有多个保守基序，编码287～627个氨基酸，其中，有15个蛋白为亲水性蛋白，6个为疏水性蛋白。对CsANR家族基因的顺势作用元件分析表明CsANR家族含有光响应、防御和胁迫响应、植物激素响应（茉莉酸甲酯、生长素、脱落酸及赤霉素）和低温响应元件，说明该基因家族可能在参与植物生长发育及应对胁迫中发挥作用，本研究结果可为茶树ANR基因功能研究提供依据。

关键词：茶树；花青素还原酶；基因家族；鉴定；分析

中图分类号：S571.1

文献标志码：A

茶树（Camellia sinensis）是山茶科、山茶属灌木或小乔木。茶树起源于中国，是一种非常重要的叶型经济作物，且在我国已经有2000多年的种植历史［1-2］。同时，茶树作为经济作物在世界上 30 多个国家广泛种植［3-4］。茶是一种不含酒精的饮料，因其具有多种健康功效而得到广泛关注［5］。目前，茶已成为世界上消费最多的饮料之一［6］。

茶多酚是茶树中主要的次生代谢产物，包括酚酸［7］、黄酮醇、黄烷-3-醇（儿茶素）、黄酮、花青素和原花青素等［8］。原花青素是花青素在花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）的催化下形成的产物［9］，原花青素含量不仅影响茶饮料制品的口感［10］，同时还具有多种保健功能，包括抗氧化、抗癌、降低毛细血管通透性、增强心血管活性、抗病毒、抗真菌活性、抗辐射、保护肝脏、改善学习记忆能力等众多功效 ［11-15］，因此原花青素对茶叶质量有着重要作用。ANR作为原花青素生物合成途径中的关键酶之一，众多学者对其进行了广泛研究［16-22］，并在拟南芥［23］、蒺藜状苜蓿［24］、葡萄［9］、艾纳香［22］、银杏［25］、红花［26］、桑树［27］、红豆草［28］等植物中进行了克隆及研究。Punyasiri等［29］对鲜茶叶的研究表明ANR能够转化矢车菊色素生成儿茶素（EC）和没食子儿茶素（EGC）。李军等［27］对桑树花青素还原酶MaANR的克隆及表达分析表明，MaANR可能是桑葚中花青素积累的重要负调控因子。对红花花青素还原酶基因ANR的研究表明，CtANR基因都是在果球形成初期表达量最低，在花发育的不同时期，红色红花品种和白色红花品种中的表达趋势不一致。

目前，关于茶树ANR基因的研究已有报道［21，29-30］，但关于茶树ANR基因功能研究还比较缺乏。随着基因组学技术及生物信息学技术的发展，为茶树基因功能的研究提供了一种新的思路，且茶树中ANR基因家族的鉴定还未见报道。因此，本研究利用生物信息学方法对茶树ANR基因家族进行系统分析，为深入研究茶树ANR基因以及培育高花青素茶树新品种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 茶树ANR基因家族的鉴定

从茶树基因组网站TPIA（http：//tpia.teaplant.org/index.html）下载‘舒茶早品种的基因组数据及其注释文件，根据已报道的茶树ANR基因序列，利用TBtool软件［31］工具进行全基因组搜索，剔除冗余序列后利用Pfam（http：//pfam.xfam.org）和 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）对所有候选的茶树ANR蛋白质序列进行结构域鉴定。

1.2 茶树ANR蛋白理化性质分析

通过在线分析工具ProtParam（http：//pfam.xfam.org）对CsANR蛋白序列进行理化性质分析，利用CBS 在线分析工具SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）和TMHMM Server v2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）对CsANR蛋白序列的信号肽、跨膜结构域进行分析，通过在线分析软件ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）对CsANR蛋白氨基酸序列的亲疏水性进行分析，并用在线软件PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）和Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）對CsANR蛋白的二级结构进行分析预测和同源建模，Plant-mPLoc［32］软件进行亚细胞定位预测。

1.3 茶树ANR蛋白进化树的构建

在phytozome 12 （https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html） 网站上分别下载苹果Malus pumila Mill.、葡萄Vitis vinifera L.、杨树Populus L.的共20条ANR蛋白序列与鉴定出的茶树ANR蛋白序列，利用ClustalX 1.83软件［33］进行同源比对，并采用MEGA X软件［34］的相邻连接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树，校验参数BootStrap重复为1 000次，其他参数均为默认值。

1.4 茶树ANR基因启动子顺式作用元件预测

根据各基因在基因组的序列位置，截取起始密码子ATG上游2 000 bp序列用于顺式作用元件分析，将启动子序列提交到PlantCare网站（http：//bioinformatI-cs.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测， 并利用TBtools软件对分析结果进行可视化作图。

1.5 茶树ANR蛋白保守基序分析

利用MEME在线网站（https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html）对茶树CsANR蛋白的保守基序进行预测，参数预测数目设为10，长度设为6～50，其他参数均为默认设置。

1.6 茶树ANR蛋白二级结构预测

运用SOPMA软件［35］预测茶树ANR蛋白质的二级结构。

2 结果与分析

2.1 茶树ANR基因的全基因组鉴定

通过对已公布的茶树ANR序列进行结构域分析，发现ANR基因家族共有6个保守结构域，分别为 NmrA（PF05368）、3Beta_HSD（PF01073）、NAD_binding_10（PF13460）、NAD_binding_4（PF07993）、GDP_Man_Dehyd、Epimerase（PF01370）。最终从茶树基因组中鉴定出21个ANR基因，根据其在染色体上的分布，分别命名为CsANR1～CsANR21，21个ANR基因的基本信息如表1所示。

2.2 茶树ANR基因理化性质的分析

对茶树21个ANR基因的蛋白序列进行理化性质分析，结果如表2所示。结果表明，茶树ANR基因家族成员的氨基酸大小、分子量及等电点差异较大。CsANRs基因家族成员的编码序列长度为864～1 884 bp，编码的氨基酸数目为287～627个，相对分子量31.446～511.230 kDa，理论等电点5.14～9.27，脂溶系数75.41～101.94。不稳定系数小于40的定义为稳定蛋白，因此21个成员中有14个成员为稳定蛋白，其余7个为不稳定蛋白。

对21个ANR蛋白信号肽预测显示CsANR蛋白均不含信号肽，说明CsANRs蛋白为非分泌蛋白，不能引导蛋白质的跨膜运输。同时，亚细胞定位结果表明，21个成员中有8个成员定位于高尔基体，分别为CsANR1、CsANR5、CsANR6、CsANR8、CsANR9、CsANR11、CsANR13和CsANR19；CsANR2、CsANR10、CsANR15和CsANR16定位于细胞质；CsANR3和CsANR12定位于叶绿体、细胞质和高尔基体；CsANR7和CsANR17定位于叶绿体和细胞质；CsANR4、CsANR14、CsANR18、CsANR20、CsANR21定位于葉绿体和高尔基体，说明茶树ANR家族主要在细胞器或细胞质中行使功能。跨膜结构域分析结果显示有9条序列存在该结构域，12条序列无跨膜结构域。根据亲水性总平均值大于零的为疏水蛋白，小于零为亲水蛋白的划分依据，有15个蛋白为亲水性蛋白，6个为疏水性蛋白。

2.3 茶树ANR系统发育树的构建

为了分析茶树ANR基因家族的进化关系，选取苹果（12 个）、葡萄（4个）、杨树（4个）的 ANR基因，与本研究鉴定出来的茶树21个ANR基因构建系统进化树。结果如图1所示，21个CsANRs基因可分为 7个亚族。茶树有20个CsANRs基因全部聚在一起，而CsANR5单独成为一个分支，说明茶树ANR基因家族大部分成员与其他物种的相似度较高。

2.4 茶树ANRs基因启动子顺式作用元件分析

如图2，对茶树ANR基因21个成员的启动子区分析发现，CsANRs基因除含有多个真核生物启动子必须的 CAAT-Box和 TATA-box元件之外，所有序列都含有光响应元件、植物激素响应元件，其中，13条序列含有厌氧诱导所必须的顺式作用调控元件，7条序列含有茉莉酸甲酯响应元件，部分序列含有低温响应元件、赤霉素响应元件等，这些结果说明 CsANRs基因在调节光吸收及抵御非生物胁迫方面可能具有重要作用。

2.5 茶树ANR基因家族蛋白保守基序预测

对茶树21个基因序列的保守基序分析结果如图3所示。除CsANR5蛋白质只包含motif1、motif2、motif4和motif5这4个基序外，其余20个序列均包含motif1、motif2、motif3、motif4和motif5，说明motif1、motif2、motif4和motif5是ANR家族的重要保守基序。此外，除CsANR6、CsANR7、CsANR17 和CsANR21外，其他序列均有5个保守基序。CsANR6、CsANR7、CsANR17 和CsANR21分别含有6个、7个、6个、7个基序。

2.6 茶树ANR 基因家族蛋白二级结构预测

对茶树21个ANR蛋白的二级结构分析表明，CsANRs蛋白二级结构中主要以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链结构为主，β-转角所占比例均较小。其中CsANR1、CsANR2、CsANR3、CsANR4、CsANR5、CsANR6、CsANR8、CsANR11、CsANR12、CsANR13、CsANR15、CsANR16、CsANR17、CsANR18和CsANR21均以α-螺旋结构所占比例最大，占比为40.12%～50.14%，其次为无规则卷曲结构，占比29.97%～37.21%。CsANR7、CsANR9、CsANR14和CsANR19则以无规则卷曲结构占比最大，为39.07%～40.77%，其次为α-螺旋结构，为37.32%～38.92%。CsANR10和CsANR20的α-螺旋结构和无规则卷曲结构所占比例一样，分别为38.90%和36.31%。

3 结论与讨论

本研究通过生物信息学技术从‘舒早茶的全基因组中共鉴定出21个茶树ANR基因，与前人从川桑［36］、芒果［37］和拟南芥［9］中分别鉴定出1、3、1个ANR基因相比，从茶树中鉴定出来的ANR基因数量明显多于川桑、芒果和拟南芥，这可能也是茶树中花青素含量高于其他物种的原因。21个ANR家族基因分为7个亚家族。

对茶树ANR蛋白理化性质的分析表明，21个ANR蛋白中，15个为亲水性蛋白，6个为疏水性蛋白，而亲水性蛋白质能够有利于植物抵抗非生物胁迫的能力［38］。茶树ANR蛋白亚细胞定位结果分析显示，21个成员中有8个位于细胞质中，其余13个成员主要位于叶绿体、细胞质和高尔基体中，这可能与CsANR承担的功能有关。花青素还原酶能将有色的花青素（矢车菊素、天竺葵素、翠雀素）还原成表儿茶素，然后通过向液泡转运聚合成为原花青素，而对花青素含量形成负调控作用［39-40］。

对茶树ANR家族基因启动子响应元件分析，结果显示茶树ANR基因的表达可能受到光响应、防御和胁迫响应、植物激素响应（茉莉酸甲酯、生长素、脱落酸及赤霉素）、低温响应元件等作用元件的调控，这些作用元件在植物生长发育、响应环境胁迫中发挥重要作用［41］。例如，脱落酸（ABA）调控种子萌发、植物发育以及生物和非生物胁迫响应的关键过程，ABA通过触发气孔关闭，限制蒸腾作用中的水分流失，并调动一系列基因，从而保护细胞免受长期应激中发生的氧化损伤［42-43］。赵磊［8］对ANR基因的研究表明，转CsMYB5-2的烟草植物花中DMACA显色的原花青素含量出现明显的提高。对桑树花青素还原酶基因MaANR表达量的测定表明，MaANR在桑葚中的表达量最高，而在其他部位和组织中的表达量极低，说明MaANR基因的表达具有组织特异性［27］。

花青素还原酶是花青素生物代谢途径中的关键酶，可催化花青素为黄烷醇类物质，该酶通过调节植物不同组织中花青素的积累影响植物对光的吸收程度和叶面温度，提高茶树的防御力和对环境的适应性。本研究利用生物信息学方法鉴定茶树中的ANR家族基因，同时，对其序列特征、基因结构、亚细胞定位、蛋白二级结构预测等进行系统分析，为更好地了解ANR基因在花青素生物代谢过程中的作用提供参考。

参考文献：

[1]陈伟， 吕晓杰， 宋晓敏， 等. ‘紫鹃茶树紫叶和绿叶差异表达蛋白分析［J］. 福建农业学报， 2016， 31（3）： 230-235.

［2］ 杨琴， 赵磊， 刘亚军， 等. 茶树花青素还原酶的酶学特性研究［J］. 茶叶科学， 2013， 33（3）： 221-228.

［3］ MONDAL T K， BHATTACHARYA A， LAXMIKUMARAN M， et al. Recent advances of tea （Camellia sinensis） biotechnology［J］. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2004， 785（76）： 195-254.

［4］ PRIYA P， VENKATACHALAM P， THULASEEDHARAN A. Molecular cloning and characterization of the rubber elongation factor gene and its promoter sequence from rubber tree （Hevea brasiliensis）： a gene involved in rubber biosynthesis［J］. Plant Science， 2006， 171（4）： 470-480.

［5］ LIN Y， TSAI Y J， TSAY J S， et al. Factors affecting the levels of tea polyphenols and caffeine in tea leaves［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2003， 51（7）： 1864-1873.

［6］ WANG Y X， LIU Z W， WU Z J， et al. Genome-wide identification and expression analysis of GRAS family transcription factors in tea plant （Camellia sinensis）［J］. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 1-11.

［7］ DEVIC M， GUILLEMINOT J， DEBEAUJON I， et al. The BANYULS gene encodes a DFR-like protein and is a marker of early seed coat development［J］. The Plant Journal， 1999， 19（4）： 387-398.

［8］ 趙磊. 茶树类黄酮合成转录因子筛选及ANR基因功能验证［D］. 合肥： 安徽农业大学， 2013.

［9］ 黄昕颖. 葡萄花青素还原酶（ANR）基因遗传转化优质黑米的研究［D］. 福州： 福建农林大学， 2012.

［10］吕晓玲， 孙晓侠， 姚秀玲. 采用荧光化学发光法分析紫甘薯花色苷产品的抗氧化作用［J］. 食品与发酵工业， 2005（9）： 57-59.

［11］SINIA D P T， MARIA T S B. Anthocyanins： from plant to health［J］. Phytochemistry Reviews， 2008， 7（2）： 281-299.

［12］JOSHI R， RANA A， KUMAR V， et al. Anthocyanins enriched purple tea exhibits antioxidant， immunostimulatory and anticancer activities［J］. Journal of Food Science and Technology， 2017， 54（7）： 1953-1963.

［13］PANG Y Z， PEEL G J， WRIGHT E， et al. Early steps in proanthocyanidin biosynthesis in the model legume Medicago truncatula［J］. Plant Physiology， 2007， 145（3）： 601-615.

［14］ZHANG L S， SUN X M， WILSON I W， et al. Identification of the genes involved in anthocyanin biosynthesis and accumulation in Taxus chinensis［J］. Genes， 2019， 10（12）： 982.

［15］高晨曦， 黄艳， 孙威江. 茶叶中原花青素研究进展［J］. 茶叶科学， 2020， 40（4）： 441-453.

［16］HUANG W， CHEN X， GUAN Q J， et al. Changes of alternative splicing in Arabidopsis thaliana grown under different CO2 concentrations［J］. Gene， 2019， 689： 43-50.

［17］SINGH K， RANI A， PAUL A， et al. Differential display mediated cloning of anthocyanidin reductase gene from tea （Camellia sinensis） and its relationship with the concentration of epicatechins［J］. Tree Physiology， 2009， 29（6）： 837-846.

［18］DONG W K， MA H L， CHEN C Y， et al. Overexpression of the OvBAN gene enhances the proanthocyanidin content in transgenic alfalfa （Medicago sativa L.）［J］. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2020， 56（4）： 548-557.

［19］DIXON R A， XIE D Y， SHARMA S B. Proanthocyanidins： a final frontier in flavonoid research ［J］. New Phytologist， 2005， 165： 9-28.

［20］骆洋， 王弘雪， 王云生， 等. 茶树花青素还原酶基因在大肠杆菌中的表达及优化［J］. 茶叶科学， 2011， 31（4）： 326-332.

［21］郑华坤， 黄志伟， 颜霜飞， 等. 茶树花色素还原酶基因的克隆与原核表达［J］. 福建农林大学学报（自然科学版）， 2008（6）： 620-624.

［22］鞠志刚， 蒋梦星， 王文斌， 等. 苗药艾纳香花青素还原酶基因的克隆及其生物信息学分析［J］. 分子植物育种， 2018， 16（22）： 7270-7274.

［23］MARSHALL C M， TARTAGLIO V， DUARTE M， et al. The Arabidopsis sickle mutant exhibits altered circadian clock responses to cool temperatures and temperature-dependent alternative splicing［J］. The Plant Cell， 2016， 28（10）： 2560-2575.

［24］XIE D Y， SHARMA S B， DIXON R A. Anthocyanidin reductases from Medicago truncatula and Arabidopsis thaliana［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2004， 422（1）： 91-102.

［25］SHEN G A， PANG Y Z， WU W S， et al. Isolation and characterization of a putative anthocyanidin reductase gene from Ginkgo biloba［J］. Journal of Plant Physiology， 2006， 163（2）： 224-227.

［26］魯丹丹， 谭政委， 李磊， 等. 红花花青素还原酶基因ANR的克隆及表达分析［J］. 核农学报， 2022， 36（3）： 517-526.

［27］李军， 梁燕梅， 赵爱春， 等. 桑树花青素还原酶基因MaANR的克隆和表达分析［J］. 蚕业科学， 2016， 42（4）： 570-575.

［28］陈春艳， 马晖玲， 董文科， 等. 甘肃红豆草BAN基因克隆与双标记选择表达载体构建［J］. 核农学报， 2016， 30（10）： 1880-1888.

［29］PUNYASIRI P A N， ABEYSINGHE I S B， KUMAR V， et al. Flavonoid biosynthesis in the tea plant Camellia sinensis： properties of enzymes of the prominent epicatechin and catechin pathways［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2004， 431（1）： 22-30.

［30］骆洋. 茶树花青素还原酶基因的原核表达［D］. 合肥： 安徽农业大学， 2011.

［31］CHEN C J， CHEN H， ZHANG Y， et al. TBtools： an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］. Molecular Plant， 2020，13（8）： 1194-1202.

［32］CHOU K C， SHEN H B. Plant-mPLoc： a top-down strategy to augment the power for predicting plant protein subcellular localization［J］. PLoS One， 2010， 5（6）： e11335.

［33］LARKIN M A， BLACKSHIELDS G， BROWN N P， et al. Clustal W and clustal X version 2.0［J］. Bioinformatics， 2007， 23（21）： 2947-2948.

［34］KUMAR S， STECHER G， LI M， et al. MEGA X： molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms［J］. Molecular Biology and Evolution， 2018， 35（6）： 1547-1549.

［35］GEOURJON C， DELEAGE G. SOPMA： significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments［J］. Computer Applications in the Biosciences， 1995， 11（6）： 681-684.

［36］孟帥. 川桑原花青素合成关键酶基因LAR和ANR的鉴定与功能研究［D］. 重庆： 西南大学， 2019.

［37］TAN L， WANG M， KANG Y F， et al. Biochemical and functional characterization of anthocyanidin reductase （ANR） from Mangifera indica L.［J］. Molecules，2018， 23（11）： 2876.

［38］周辉， 宋莉， 赵德刚. 大肠杆菌HspQ基因的生物信息学分析［J］. 山地农业生物学报， 2018， 37（5）： 57-61.

［39］波杨， 刘海霞， 牛铁泉， 等. TRV介导的葡萄叶片VvANR基因瞬时表达分析［J］. 核农学报， 2021， 35（4）： 826-836.

［40］HAN Y， VIMOLMANGKANG S， SORIA G R E， et al. Introduction of apple ANR genes into tobacco inhibits expression of both CHI and DFR genes in flowers， leading to loss of anthocyanin［J］. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（7）： 2437-2447.

［41］杨芳， 杨仕梅， 罗雪， 等. 百脉根Hsp70s基因家族的生物信息学分析［J］. 山地农业生物学报， 2020， 39（5）： 1-8.

［42］LEE S C， LUAN S. ABA signal transduction at the crossroad of biotic and abiotic stress responses［J］. Plant， Cell & Environment， 2012， 35（1）： 53-60.

［43］WASILEWSKA A， VLAD F， SIRICHANDRA C， et al. An update on abscisic acid signaling in plants and more［J］. Molecular Plant， 2008， 1（2）： 198-217.

（责任编辑：曾 晶）

Genome-Wide Identification and Analysis of ANR

Gene Family in Camellia sinensis

DUAN Lili1，2， LI Kuiyin*3

（1.College of Agriculture， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 2.Journal Editorial Department， Guizhou University， Guiyang 550025， China; 3.College of Agriculture， Anshun University， Anshun 561000， China）

Abstract：

Anthocyanin reductase （ANR） is one of the key enzymes in the biosynthetic pathway of procyanidins. In order to improve the defense ability and adaptability of Camellia sinensis to the environment， ANR affects the light absorption and leaf surface temperature of Camellia sinensis by regulating the accumulation of anthocyanins in different Camellia sinensis tissue. Using bioinformatics analysis methods， we identified the members of the Csamellia sinensis ANR gene family from the ‘Shuchazao genome data， and analyzed the gene structure， protein physical and chemical properties， conservative motifs and homeopathic elements of the family members. The results showed that there were 21 members of the CsANR family， which were divided into 7 classes， containing multiple conservative motifs， encoding 287-627 amino acids， of which 15 proteins were hydrophilic proteins and 6 were hydrophobic proteins. Analysis of cis-elements of CsANR family genes showed that CsANRs genes contain light response， defense and stress response， plant hormone response （methyl jasmonate， auxin， abscisic acid and gibberellin） and low temperature response elements， indicating that the ANR gene family may play a role in plant growth and development and stress response. The results of this study can provide a basis for research on the function of Csamellia sinensis ANR genes.

Key words：

Camellia sinensis; anthocyanidin reductase; gene family; identification; analysis

收稿日期：2022-11-03

作者简介：段丽丽（1989—），女，编辑，在读博士，研究方向：作物遗传育种，E-mail：llduan1@gzu.edu.cn.