冷藏期内红阳猕猴桃软腐病病原菌的分离与鉴定

凌立贞 陈林燕 涂丹丹 张书东

摘要 为明确导致贮藏期红阳猕猴桃果实软腐的病原菌种类，本研究以冷藏期红阳猕猴桃病果为试材，采用组织块分离法分离软腐病病原菌，按照科赫法则确定分离病株的致病性，同时采用形态学结合分子鉴定技术对病原菌种类进行鉴定。结果表明，共有4种软腐病病原菌被鉴定，分别是拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）、间座壳菌（Diaporthe sp.）、互隔链格孢菌（Alternaria alternata）和细极链格孢菌（A. tenuissima）。上述4种病原菌是新鉴定的冷藏期红阳猕猴桃果实软腐病的病原菌，其中细极链格孢菌作为猕猴桃果实软腐病病原菌被首次报道。

关键词 红阳猕猴桃；软腐病；病原菌；冷藏期

中图分类号 S436.634.1+1   文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）06-0114-05

Abstract The pathogens were isolated from the decayed Hongyang kiwifruit during cold storage by tissue isolation method followed by Koch's postulates pathogenicity test. In this study， phenotypic and molecular techniques were applied to characterize the causal agents of Hongyang kiwifruit rot. Results showed a total of four pathogenic fungi were identified， including Phomopsis sp.， Diaporthe sp.， Alternaria alternata and A. tenuissima， which became the new pathogens of Hongyang kiwifruit during storage. Especially， this is the first proof that A. tenuissima as the causal agents can cause the decay of kiwifruit.

Keywords Hongyang kiwifruit; fruit rot; pathogen; cold storage

紅阳猕猴桃（Hongyang kiwifruit）为猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）多年生木质藤本植物，是我国选育出的首个红肉型中华猕猴桃（Actinidia chinensis var. rufopulpa）品种，目前已被列为国家级品种保护资源[1]。红阳猕猴桃具有丰富的营养成分，每100 g鲜果肉中含维生素C约350 mg，含量是苹果的100倍，被誉为“维C之王”[2]；鲜果富含稀有天然维生素E、17种游离氨基酸和多种矿物质成分，具有抗癌、抗肝损伤、抗病毒和抗衰老等医疗保健作用[3-4]。另外，红阳猕猴桃因其果实较大，果形整齐，果心鲜红色，肉质细嫩，口感鲜美而备受青睐。近年来种植面积在国内外迅速扩大，四川和贵州是我国红阳猕猴桃的主产区，其产量已跃居世界前列。

然而，红阳猕猴桃果实在采后贮藏过程中极易腐烂，严重影响其口感和品质[5-6]。研究表明，红阳猕猴桃果实采后易腐烂，主要是由自身的呼吸生理状况（如呼吸强度、乙烯释放速率）和外界因素共同影响的。一方面，红阳猕猴桃属于呼吸跃变型果实，在贮藏过程中呼吸高峰出现后就进入了衰亡阶段，此时已经丧失了保鲜价值；另一方面，红阳猕猴桃果实皮薄多汁、含糖量高，容易受到病原菌的侵染。红阳猕猴桃果实在采集前后均可遭受病原菌的侵染[3，7]。采集前的侵染通常是病原菌在果实生长时期侵入其内部，直至成熟时才开始出现症状；采集后的侵染主要是病原菌的孢子寄生在果实表面，当环境条件适宜时萌发并通过伤口或皮孔侵入果实内部后引发发病。

软腐病又称熟腐病，是贮藏期红阳猕猴桃果实腐烂的主要病害之一[3，8-10]。它是由真菌通过伤口侵入果实内部而引起的，其发病率高达50%，给猕猴桃产业造成了巨大的经济损失[11-15]。雷霁卿和潘慧等[7-8，16]通过调查研究多个果园内的红阳猕猴桃病果，发现导致软腐病的病原菌种类很多，主要有拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）、间座壳菌（Diaporthe sp.）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、小新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）、拟盘多毛孢（Pestalotiopsis sp.）和互隔链格孢菌（Alternaria alternata）。目前，在采后或贮藏期的红阳猕猴桃上发现的软腐病病原菌种类较少，仅B. dothidea被报道[9，17]。但在海沃德、华优和徐香等其他品种的贮藏期果实中已鉴定出5种软腐病病原菌[18]：多变根毛霉菌Mucor irregularis（Rhizomucor variabilis）、黑斑病菌（Alternaria brassicae）、葡萄座腔菌、互隔链格孢菌、间座壳菌（Diaporthe eres）。本研究通过对冷藏期红阳猕猴桃软腐病病原菌的分离和鉴定，进一步明确引起软腐病的病原菌种类，为探究贮藏期红阳猕猴桃软腐病的有效防治措施奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从六盘水市水城县一字河猕猴桃交易市场贮藏冷库中收集具有典型软腐病特征的红阳猕猴桃病果作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离和纯化。采用常规组织分离培养法分离纯化病原菌菌株。具体操作如下：①红阳猕猴桃病斑及周围的组织依次用75%乙醇和0.5%次氯酸钠擦拭消毒；②用无菌手术刀在红阳猕猴桃果实病健交界处切取3～5 mm的果肉组织，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL）上进行培养，并定期观察；③待出现菌落后挑取尖端菌丝于新的PDA培养基进行纯化，直至获得纯菌株。每个样本设置3个重复。

1.2.2 病原菌株培养及菌落特征观察。纯培养菌株的菌落形态特征记录要点参照吴文能等[19]的方法。

1.2.3 病原菌株基因组DNA的提取。取适量培养基上的菌丝置于研钵，加入液氮研磨至粉状，转入1.5 mL 离心管中，加入0.6 mL pH 8.0 TE溶液，使菌体充分悬浮。依次加入不同的物质进行混匀和水浴（250 ?L 10% SDS；3 μL 20 ng/?L 蛋白酶K，37 ℃水浴1 h；150 ?L 5 mol/L NaCl；150 ?L 2% CTAB，65 ℃水浴20 min）。然后，室温下12 000 rpm离心20 min，吸取上清液至新的1.5 mL离心管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置30 min，12 000 rpm，4 ℃离心10 min后去上清液，倒置离心管沥干。加750 ?L 70%乙醇，轻弹管壁使沉淀悬浮，12 000 rpm，4 ℃离心2 min收集沉淀。每管加入30 ?L纯化水（水中加RNase）溶解沉淀，终浓度为10 ng/?L，备用。

1.2.4 病原菌株的分子鉴定。提取真菌基因组DNA后，采用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG ）/ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）扩增真菌核糖体基因组转录间隔区（ITS）。采用引物H3-1a（ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG）/H3-1b（GCGGG CGAGCTGGATGTCCTT）扩增histone3基因，进一步鉴定细极链格孢病原菌。扩增后的PCR产物送往华大基因公司进行两端测序。获取的序列用DNAMAN软件进行拼接，得到的一致性序列与NCBI上已知的菌株序列进行Blast比对，作同源性分析。

1.2.5 病原菌菌株的致病性测定。接种不同物种的菌株于PDA平板上，在25 ℃条件下培养，待适龄后用打孔器取直径为5 mm的菌饼；健康的红阳猕猴桃果实进行表面消毒并用接种针刺伤果实，深度为2～3 mm；将菌饼的菌丝面紧贴于果实伤口处，放入透明盒中進行密封培养。定期观察发病情况。以刺伤果实接种无菌PDA琼脂块为对照。每种处理设置3个生物学重复。

1.2.6 细级链格孢菌孢子的诱导及形态观察。将细级链格孢菌的菌丝接种于玉米粉培养基（CMA：玉米粉6 g、葡萄糖6 g、琼脂10 g，蒸馏水500 mL）上光照诱导培养6～8 h，后置于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养。培养14 d后产生分生孢子，挑取分生孢子至灭菌蒸馏水中，吸取少量孢子液于载玻片上，放置显微镜下进行观察。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2003对试验数据进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态特征及致病性

从红阳猕猴桃病果上分离纯化得到68株菌株，根据其菌落形态特征可以划分为4种类型。各类型病原菌代表菌株编号依次为P1-1w、Z1-1n、G1-1w和P1-2w，其菌落形态特征描述如下：

（1）Z1-1n菌株形态。菌落菌丝白色，呈棉絮状，有同心轮纹，呈放射状生长，生长速率10.0～12.5 mm/d，菌落边缘不整齐，正面似玫瑰花纹，背面中部轮状生长处有青色附着（图1a）。

（2）G1-1w菌株形态。菌落菌丝洁白，呈棉絮状，分布不均匀，有同心圆状纹饰，呈放射状生长，生长速率14.8～15.2 mm/d，生长较快，菌落边缘不整齐，正面气生菌丝少，中心菌丝稀疏，背面黄白色（图1b）

（3）P1-1w菌株形态。菌落菌丝绒毛状、致密，生长速率8.8～11.3 mm/d，呈放射状生长，菌落边缘不整齐，正面表面灰白色，背面中部黑褐色，边缘棕色至灰白色（图1c）。

（4）P1-2w菌株形态。菌落菌丝绒毛状、致密，生长速率8.7～10.8 mm/d，呈放射状生长，菌落边缘不整齐，正面表面灰白色，背面中部黄褐色，边缘棕色至灰白色（图1d）。

致病性测定结果表明，4种类型代表菌株在刺伤接种后均可致病（图2b-e），果实发病症状与自然发病症状一致。所有对照处理均无发病症状。对接种后发病果实的病斑进行再分离培养，均可得到与接种病原菌菌落特征一致的菌株。

2.2 病原菌的分子鉴定

扩增4种类型病原菌代表菌株的ITS序列，经测序拼接后得到大小约550 bp的序列。序列提交至NCBI数据库，登录号分别为P1-1w（ON165681）、P1-2w（ON165682）、Z1-1n（ON165683）和G1-1w（ON165685）。与GenBank已知序列进行同源性比对分析，结果表明：G1-1w和Z1-1n分别与拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）和其有性型间座壳菌（Diaporthe sp.）的同源性较高，超过99.4%；而P1-1w和P1-2w分别与链格孢属（Alternaria）的互隔链格孢（A. alternata）和细极链格孢（A. tenuissima）同源性均为100%（表1）。上述4种病原菌中拟茎点霉菌、间座壳菌和互隔链格孢菌作为采前红阳猕猴桃软腐病的病原菌均有被报道，但在贮藏期内作为红阳猕猴桃软腐病病原菌是首次被发现；其中细极链格孢菌不管是作为采前还是采后猕猴桃软腐病病原菌还鲜见报道。

为进一步确定细极链格孢病原菌，观察了其孢子形态（图2f）：分生孢子倒棍棒状或倒梨形、棕褐色，大小为（15～40）μm×（8.3～18.4）μm（n=30），有横隔和纵隔。另外，测定了P1-2w的histone3片段序列（登录号：MT210550），结果显示，P1-2w与细极链格孢同源性为100%。根据形态特征和2个分子片段（ITS和histone3）序列，确定P1-2w为细极链格孢菌，该菌作为猕猴桃软腐病病原菌首次被报道。

3 讨论与结论

在贮藏期内，葡萄座腔菌是目前红阳猕猴桃软腐病报道的唯一一种病原菌[9，17]。该研究未分离出葡萄座腔菌，但分离鉴定出其他几种病原菌：拟茎点霉菌、间座壳菌和2种链格孢菌（细极链格孢菌和互隔链格孢菌）。上述病原菌的鉴定对红阳猕猴桃贮藏期软腐病致病菌有了更深地认识，对软腐病防治有重要意义。潘慧等[7]对六盘水市多个红阳猕猴桃果园的调查发现，拟茎点霉菌、间座壳菌和互隔链格孢菌在多个果园病果中均有分离。因此，推测上述病原菌是在采前就潜伏在红阳猕猴桃果实上，直至贮藏期才出现病症。细极链格孢菌已被证实能够引起猕猴桃叶片褐斑病[20]和果皮结痂[21]，但作为猕猴桃软腐病病原菌在该研究中首次被报道。

潘慧等[7]对多个果园样品软腐病的鉴定发现，并非每个果园的致病菌均相同。刘娜等[22]研究表明，葡萄座腔菌在猕猴桃软腐病的发病初期丰度有所变化，在发病后大面积腐烂时丰度减少。该研究未鉴定出葡萄座腔菌，一种原因可能是采样点较少；另一种原因可能是采样时期也有影响。除上述几种软腐病病原菌外，其他猕猴桃品种如海沃德、华优和徐香等的果实在贮藏过程中还鉴定出多变根毛霉菌和黑斑病菌[18]。综上结果表明，贮藏期红阳猕猴桃可能还有其他软腐病病原菌未被分离鉴定，或者说猕猴桃软腐病病原菌可能在不同品种间有所不同。该研究结果丰富了红阳猕猴桃贮藏期软腐病病原菌种类，其中细极链格孢菌作为猕猴桃软腐病病原菌首次被报道。

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（责编：何 艳）

基金项目 贵州省科学技术基金资助项目［（黔科合基础-ZK（2022）一般530］；六盘水市科技计划项目（52020-2019-05-05）；六盘水师范学院大学生创新创业训练计划项目（S202010977036）。

作者简介 凌立貞（1979—），女，博士。研究方向：植物学。