神经介素B及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的差异表达
2023-05-29曾诚夏荣欣李悦刘婷婷孙宣钟黄欣郭文晴张国敏
曾诚,夏荣欣,李悦,刘婷婷,孙宣,钟黄欣,郭文晴,张国敏,*
(1.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095;2.南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室,江苏 南京 210095)
动物繁殖力是养殖行业的核心关注点,公畜繁殖力的提高对养殖业提质增效具有重要意义。睾丸发育和精子发生直接决定着公畜的繁殖力。睾丸的发育与功能调节受体内外多种因素的影响,如遗传因素、饲养水平和内分泌代谢等,其中遗传调控占主导地位[1]。有研究报道称大量蛋白编码基因和非编码RNA严格调控睾丸发育、精子生成和睾酮分泌[2-5],但睾丸生长发育及功能调节的分子机制仍不清楚。因此,对影响睾丸发育相关基因进行研究,探讨特异性表达基因与睾丸发育的相关性,不仅能为优良种公畜早期选育提供理论参考,还能为公畜睾丸发育不良等疾病的遗传机制研究提供科学依据。
神经介素B(neuromedin B,NMB)是一种从脊髓中分离得到的神经肽,与其受体(neuromedin B receptor,NMBR)结合后,通过激活细胞信号传导通路和引起细胞特异性反应而发挥生物学功能[6]。哺乳动物NMB的受体包括神经介素B受体、胃泌素释放肽受体(gastrin releasing peptide receptor,GRPR)和蛙皮素受体(bombesin receptor subtype 3,BRS3)[7]。NMB及其受体广泛分布于多个组织器官,参与动物的摄食、免疫、应激和生长等众多生理调节过程。此外,在人、兔、猪和其他模式动物中研究发现,NMB及其受体在下丘脑-垂体-性腺轴的多个器官中表达[8-9],NMB也能促进性腺轴器官分泌促性腺激素和性激素[10-11]。这些结果表明NMB及其受体可能参与动物的生殖调控。尽管自NMB及其受体发现以来,国内外学者对其进行了大量研究,但关于其参与反刍动物生殖调控的研究还鲜有报道。因此,本试验以山羊睾丸组织为研究对象,对NMB及其受体克隆并进行序列分析,研究NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的定位与差异表达,为深入探究NMB及其受体参与生殖调节提供理论依据,也为提高山羊繁殖力提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
从试验基地选取3月龄和9月龄雄性山羊各6只,阉割后采取睾丸组织,一部分保存于-80 ℃超低温冰箱中,用于后续NMB及其受体的克隆、mRNA及蛋白表达差异的检测;另一部分保存于布氏固定液中,用于后续免疫组化检测。
1.2 NMB及其受体基因克隆和序列分析
用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取睾丸组织的总RNA,质检合格后用反转录试剂盒(TaKaRa)将RNA逆转录成cDNA。参考NCBI中山羊(Caprahircus)NMB及其受体基因序列,利用Primer Premier 5.0和Oligo 7.0软件设计NMB及其受体基因的克隆引物(表1)。以睾丸组织cDNA为模板,扩增NMB及其受体基因,扩增产物经10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳检测,由北京擎科生物技术有限公司进行测序验证。
表1 NMB及其受体基因引物信息Table 1 Details of NMB and its receptors gene primes
利用BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对NMB及受体基因序列与NCBI提供的参考序列进行比对分析;使用MegAlign软件进行NMB及其受体的同源性分析;利用跨膜分析软件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0)对山羊NMB受体氨基酸序列进行跨膜结构分析。
1.3 NMB及其受体基因的荧光定量PCR检测
根据NCBI提供的序列信息,用BLAST软件设计NMB、NMBR、GRPR和BRS3基因的RT-qPCR引物(表1)。引物特异性验证正确后,按照SYBR Green Master Mix Kit说明书的操作要求,以睾丸组织cDNA为模板,检测NMB、NMBR、GRPR和BRS3基因在山羊不同发育阶段睾丸组织中的表达差异。以ACTB为内参基因,用2-ΔΔCT方法对有效数据进行统计分析。
1.4 免疫组化检测NMB及其受体蛋白的表达定位
睾丸组织经布氏固定液固定48 h后进行石蜡包埋和组织切片,参考安世钰等[12]的免疫组化步骤进行NMB及其受体蛋白在睾丸组织中的定位研究。抗体包括NMB抗体(1∶250,美国Proteintech Group公司)和NMBR抗体(1∶250)、GRPR抗体(1∶100)、BRS3抗体(1∶150,武汉华美生物工程有限公司产品);对照组用一抗来源动物血清代替一抗,其余步骤不变。
1.5 NMB及其受体蛋白的Western blot检测
用RIPA强裂解液提取山羊睾丸组织总蛋白,蛋白质变性后参考安世钰等[12]的Western blot试验步骤进行NMB及其受体蛋白在不同发育阶段睾丸组织中的差异表达研究。抗体包括NMB抗体(1∶200)、NMBR抗体(1∶1 000)、GRPR抗体(1∶500)和BRS3抗体(1∶1 000),兔抗ACTB抗体(1∶3 000,上海生工生物工程有限公司),HRP标记驴抗兔IgG(1∶4 000,Proteintech Group)(二抗)。按照ECL显影液说明书进行显影并拍照,用Image J软件进行条带灰度值分析。
1.6 数据处理与统计分析
图1 山羊NMB及其受体PCR扩增产物凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of goat NMB andits receptors productsM. DNA标准品;泳道1、2. NMB基因;泳道3、4. NMBR基因;泳道5、6. GRPR基因;泳道7、8. BRS3基因。M. DNA marker;Lane 1 and 2. NMB gene;Lane 3 and 4. NMBR gene;Lane 5 and 6. GRPR gene;Lane 7 and 8. BRS3 gene.
2 结果与分析
2.1 山羊NMB及其受体基因的克隆及序列分析
通过PCR扩增(图1)、测序和BLAST比对分析发现,以山羊睾丸组织cDNA扩增的NMB及其受体基因序列与NCBI提供的参考序列相似度超过99%。用进化树分析发现,山羊NMB及其受体基因在进化上均与绵羊的最相近,其次是牛;与鸡和鼠等相对较远(图2)。核苷酸序列比对分析发现,山羊NMB、NMBR、GRPR和BRS3基因编码区核苷酸序列与绵羊和牛的同源性均很高,分别为99.1%和96.5%、98.4%和97.6%、99.8%和98.3%、99.4%和98.3%。跨膜结构分析发现,NMBR、GRPR和BRS3均是7次跨膜的蛋白受体(图3)。
图2 山羊NMB及其受体基因的系统进化树分析Fig.2 Polygenetic tree analysis of NMB and its receptors gene in goat Anas platyrhynchos:鸭;Bos taurus:牛;Capra hircus:山羊;Gallus gallus:鸡;Homo sapiens:人;Mus musculus:小鼠;Ovis aries:绵羊;Rattus norvegicus:大鼠;Susscrofa domestica:猪。
图3 山羊NMB受体蛋白的跨膜结构预测Fig.3 Transmembrane structure prediction of NMB receptors protein in goat红色为跨膜区,蓝色为胞内区,紫色为胞外区。Red lines are transmembrane sequence;Blue lines are inside sequence;Purple lines are outside sequence.
2.2 NMB及其受体基因在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达差异
如图4所示:与3月龄山羊睾丸组织相比,NMB和GRPR基因在9月龄山羊睾丸组织中的mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05),而NMBR和BRS3基因mRNA相对表达水平显著增加(P<0.05)。
图4 NMB、NMBR、GRPR和BRS3基因在3和9月龄山羊睾丸组织中的表达差异Fig.4 The mRNA expression levels of NMB,NMBR,GRPR and BRS3 genes in testicular tissues of goats at 3- and 9-month-old3M:3月龄组3-month-old goat;9M:9月龄组9-month-old goat。同一指标中,不同字母表示差异显著(P<0.05)。In the same indicator,values with different superscript are statistically different(P<0.05).下同The same below.
2.3 NMB及其受体蛋白在不同发育阶段山羊睾丸组织中的定位
如图5所示:NMB蛋白在3月龄山羊睾丸组织的间质细胞、肌样细胞和初级精母细胞中均有表达;在9月龄山羊睾丸组织的间质细胞、肌样细胞和精子细胞中表达明显。NMBR蛋白在3月龄山羊睾丸组织的间质细胞和肌样细胞中有微弱表达;在9月龄山羊睾丸组织的间质细胞、肌样细胞和精子细胞中表达明显。GRPR蛋白在3月龄山羊睾丸组织的间质细胞和肌样细胞中呈强表达;在9月龄山羊睾丸组织的间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈强表达。BRS3蛋白在3月龄山羊睾丸组织的间质细胞和肌样细胞中呈微弱表达;在9月龄山羊睾丸组织的间质细胞、肌样细胞和精子中呈强表达。在阴性对照中,无任何蛋白着色。
图5 NMB及其受体蛋白在3和9月龄山羊睾丸组织中的定位Fig.5 Localization of NMB and its receptor protein in testicular tissues of goats at 3- and 9-month-oldGC:性原细胞Gonocytes cells;PC:前精原细胞Prespermatogonia cells;LC:间质细胞Leydig cells;MC:肌样细胞Myoid cell;ST:精子细胞Spermatozoa;SP:精母细胞Spermatocytes;SSC:精原干细胞Spermatogonia stem cells;SC:支持细胞Sertoli cells. 标尺=50 μm。Scale bar=50 μm.
2.4 NMB及其受体蛋白在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达差异
如图6所示:与3月龄山羊睾丸组织相比,NMB和GRPR蛋白在9月龄山羊睾丸组织中的表达量显著降低(P<0.05),而NMBR和BRS3蛋白的表达量显著升高(P<0.05)。
图6 NMB、NMBR、GRPR和BRS3蛋白在3和9月龄山羊睾丸组织中的差异表达Fig.6 The expression levels of NMB,NMBR,GRPR and BRS3 proteins in testicular tissuesof goats at 3- and 9-month-old
3 讨论
NMB及其受体在动物生理功能调节方面有着重要作用,但其研究目前主要集中在猪、兔和鼠等模式动物上。为研究NMB及其受体在反刍动物生殖生理功能调节中的作用,本研究以山羊睾丸组织为模板对NMB及其受体基因进行了克隆,并与主要畜禽和人进行了进化树分析和同源性比对,发现山羊NMB及其受体与绵羊和牛的同源性最高,遗传进化关系最接近,与猪的同源性及进化关系相对较近,但与禽类较远,这符合动物进化规律,也与马志禹[11]对猪的研究结果一致。氨基酸序列分析发现山羊NMBR、GRPR和BRS3蛋白均有7个跨膜结构域,属于G蛋白偶联受体,这与在人、猪和鸡等动物上的报道类似[11,13-14]。上述结果为研究NMB及其受体参与调节反刍动物生殖生理功能奠定了基础。
睾丸是产生雄激素和精子的器官,对生殖调控具有决定性作用。雄激素(如睾酮等)主要在睾丸间质细胞中合成和分泌。在本研究中,NMB及其受体NMBR、GRPR和BRS3在不同发育阶段的山羊睾丸间质细胞中均有表达,表明NMB及其受体可能参与调节睾酮的合成,这与前人在兔和猪等动物上研究结果类似[8,11]。管周肌样细胞位于生精小管界膜中,对于睾丸实质的物质交换起着重要作用。有研究报道,睾丸间质细胞产生的睾酮通过旁分泌刺激肌样细胞合成旁分泌因子,调节支持细胞功能和营养供给,从而间接影响生精细胞的发育[15-16]。在本研究中,NMB及其受体在不同发育阶段山羊管周肌样细胞中均有表达,表明NMB及其受体可能参与肌样细胞功能调节,进而影响睾丸的发育。此外,在睾丸生精小管内,NMB及其受体在9月龄山羊睾丸组织的精子细胞中强表达,表明NMB及其受体可能参与了山羊精子发生和功能调节。研究发现,G蛋白偶联受体的缺失会影响精子顶体生成和顶体反应[17-18],而NMBR、GRPR和BRS3均属于G蛋白偶联受体,这进一步说明了NMB及其受体可能参与了精子发生和功能调节。综上所述,在山羊睾丸发育过程中,NMB及其受体可能通过对睾丸多种细胞功能的调节而参与生殖调控。
在哺乳动物中,NMBR、GRPR和BRS3均属于蛙皮素受体家族,与其结合的配体主要有NMB和胃泌素释放肽(gastrin releasing peptide,GRP)2个蛙皮素样肽。尽管NMB有3种不同的受体,但仅发现NMB与NMBR有较高的亲和力,GRP对GRPR有较高的亲和力,BRS3与NMB和GRP的亲和力都很低[19]。与山羊NMBR的氨基酸序列相比,GRPR和BRS3的同源性仅为62.13%和53.07%。这些结果表明NMB与受体结合后,不同受体的作用可能发生重叠,也可能显示出其独特性,同时GRP也会竞争性结合受体而发挥作用。在本研究中,随着山羊睾丸的发育,NMBR和BRS3的表达量显著升高,而GRPR的表达量则呈下降的趋势,说明NMBR和GRPR可能结合了不同的配体参与睾丸发育的调节。此外,随着山羊睾丸的发育成熟,NMB的表达量呈下降趋势而NMBR的表达量呈上升趋势,这与马志禹[11]对猪的研究结果相反。物种不同(猪和羊等)、年龄不同(羊:3和9月龄;猪:3、30、60、90和120日龄)等可能是造成试验结果差异的主要原因。上述结果表明NMB及其受体参与了山羊睾丸生长发育的调控。
本研究表明山羊NMB及其受体与绵羊和牛的同源性最高、遗传进化关系最近,NMB及其受体在睾丸组织的间质细胞、肌样细胞和精子细胞中均有表达;NMB和GRPR的表达量随着睾丸的发育而降低,而NMBR和BRS3的表达量随着睾丸的发育而升高。这说明NMB及其受体可能与山羊睾丸生长发育密切相关,但具体调控机制还需进一步研究。