趋化因子CXCL11与其受体CXCR3在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义*

李勇，李全，乔飞，刁艳菲，黄云生，戚晓峰，安莉

215004 江苏 苏州，苏州大学附属第二医院 口腔科（李勇、李全、黄云生、戚晓峰）；215002 江苏 苏州，苏州卫生职业技术学院附属口腔医院 牙体牙髓病科（乔飞、刁艳菲、安莉）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面头颈部最常见的恶性肿瘤之一，该病五年生存率不足50%［1］，好发于唇、舌、牙龈等部位［2］，具有较高的复发率和转移率。寻找与OSCC发生、转移及预后相关的蛋白质和基因，将有助于医务工作者进行疾病的预防筛查和治疗。

CXC型趋化因子配体11（C-X-C-motif chemokine ligand11， CXCL 11）是趋化因子家族中的一员，机体稳定状态下，具有运输免疫细胞、诱导细胞增殖和凋亡等功能。但在肿瘤组织中， CXCL11常与CXC趋化因子受体3（C-X-C-motif chemokine receptor 3，CXCR3）结合，进而调节各种实体瘤的生长和转移。CXCL11在肿瘤发生的部位可与受体结合进而刺激下游信号通路，这些信号通路参与癌细胞的致瘤性、凋亡、血管生成、侵袭和转移［3-5］。然而，CXCL11和CXCR3在口腔鳞癌中的表达情况和作用尚不明确。本研究通过生物信息学手段分析相关基因差异表达的情况，通过采取免疫组化染色法检测CXCL11和CXCR3的表达情况，探讨CXCL11及受体CXCR3与OSCC发生、转移之间的相关性，为OSCC的治疗找到新的靶点，为探索OSCC发生侵袭和迁移的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 随机选取2015年1月至2022年9月间苏州大学附属第二医院就诊，且病理科已确诊的口腔鳞癌患者肿瘤组织石蜡标本67例作为OSCC组。同时选取从口腔外科其他手术切取的正常口腔黏膜组织28例，作为对照组。所有标本均由患者自愿提供，并经过苏州大学附属第二医院伦理委员会审批同意（伦理文件批号：JDLK-2022-166-01）。

1.1.2 主要仪器及试剂 Leica RM2016切片机（上海徕卡仪器有限公司），组织摊片机（金华市科迪仪器设备有限公司），烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司），显微镜（尼康仪器有限公司）；CXCL11兔抗人多克隆抗体购自江苏亲科生物研究中心有限公司， 兔抗人多克隆CXCR3抗体购于美国Abcam 公司。SP免疫组化试剂盒、DAB 试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学方法 本研究在GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜索关键词“oral”“cancer”“tumor”相应的数据集，下载微列阵数据GSE30784进行分析，以正常口腔黏膜组作为对照，从而分析口腔鳞癌中差异表达的基因。同时利用Cytoscape 3.7.2 数据库进行基因本体（Gene Ontology，GO）的富集分析，检验差异表达基因在某个网络中是否富集，分析上调的差异表达基因的生物学行为。

1.2.2 资料收集 所选取病例均已经过手术治疗，术前未曾接受化疗、放疗等其他辅助治疗。通过借阅OSCC组术后病理报告及查阅患者的住院记录，对所选取的病理标本进行分析。依据国际抗癌联盟2010版的原则进行分类，并记录患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度及淋巴结转移情况等信息，同时电话随访所有实验组患者，收集其术后生存状态。对照组则选自如外伤创缘修整、开窗助萌等手术过程中废弃的正常口腔黏膜组织。将以上收集到的信息进行整理。

1.2.3 免疫组织化学染色 对所选取的石蜡标本做4 μm厚连续切片，切片置烤箱中以67℃烤90 min，脱蜡，水化，枸橼酸抗原修复液进行抗原修复，喷气后3 min，室温冷却，PBS冲洗 5 min×3 次，滴加CXCL11多克隆抗体 （1∶200） 及CXCR3多克隆抗体 （1∶200） ，4℃恒温下孵育过夜，次日滴入二抗工作液，37℃ 孵育 30 min ； 使用蒸馏水冲洗 3 min ，继而 PBS 冲洗 3 min × 3 次； DAB 显色，蒸馏水冲洗终止显色反应。苏木精复染，蒸馏水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

1.3 免疫组化结果判定

所用切片经过两位专职的病理科医师，双盲法进行独立评估，互换切片后，再次进行判断，当结果有异，交换意见或由上级医师做最终判断。随机选取每个切片5个高倍镜（×400）下无重叠的视野，各视野分别计数200个细胞，根据染色的强弱及阳性细胞的占比情况，采取半定量积分法进行分析：（1）根据染色强度：无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；（2）阳性细胞比率0～5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分，将染色强度评分与相应的阳性细胞比率评分乘积（0～12）作为判定依据，乘积≥2计为阳性，乘积 ＜ 2计为阴性。

1.4 统计学方法

本实验应用 SPSS 26.0 统计软件对数据进行统计分析，通过χ2检验分析 CXCL11和 CXCR3的表达与口腔鳞癌临床病理特征之间的关系，对CXCL11和CXCR3在OSCC中的表达相关性分析采用Spearman 等级相关性分析，采用Kaplan-Meier对存活率进行分析，并应用对数秩检验计算差异，以P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学结果

在GSE30784数据集中，共167例OSCC样本和45例正常口腔黏膜组织样本纳入研究，CXCL11在OSCC组与对照组中呈现差异性表达，且CXCL11在OSCC 中表达上调（LogFC = 3.545，P ＜0.001），位于火山图中红色区域（图1A）。进一步通过GO富集分析，结果显示CXCL11主要富集于细胞侵袭和细胞迁移（图1B），说明CXCL11可能参与了OSCC的发生发展过程。

图1 生物信息学结果分析Figure 1.Analysis of Bioinformatics Results

2.2 免疫组化结果

图2显示CXCL11表达于细胞质中，弥漫或散在分布，表现为棕色、棕褐色颗粒；CXCR3主要定位于细胞膜和细胞质中，阳性表达的细胞被染色为黄色、棕色或棕褐色。

图2 CXCL11和CXCR3在OSCC组织和正常口腔黏膜组织中的表达（SP法，×400）Figure 2.Expressions of CXCL11 and CXCR3 in OSCC （SP， ×400） and Normal Oral Mucosa Tissues （SP， ×400）

2.3 CXCL11和CXCR3在OSCC及正常口腔黏膜组织中的表达

CXCL11及CXCR3在OSCC组中阳性表达率分别为 68.7%（46/67）和 74.6%（50/67），显著高于在对照组中的检出率32.1% （9/28）和39.3%（11/28），两组之间差异具有统计学意义（P ＜ 0.05；表1）。

表1 CXCL11和CXCR3在正常口腔黏膜和口腔鳞癌组织中的表达Table 1.Expressions of CXCL11 and CXCR3 in Normal Oral Mucosa and Oral Squamous Cell Carcinoma Tissues

2.4 OSCC组中CXCL11、CXCR3与临床病理参数的关系

OSCC组中高分化口腔鳞癌42例，中、低分化25例；男性37例，女性30例；肿瘤直径 ＞ 4 cm 有27例，≤4 cm 有40例；患者年龄34～82岁；临床分期：I～II期48例，III～IV 期19例；淋巴结转移26例，无淋巴结转移41例。表2结果显示，CXCL11的阳性表达与OSCC的分化程度（χ2= 13.856，P ＜ 0.001）、临床分期程度（χ2= 5.341，P = 0.021）、淋巴结转移（χ2= 5.028，P = 0.025）之间具有显著相关性，差异均有统计学意义；CXCR3的阳性表达与 OSCC 分化程度（χ2= 6.357，P = 0.012）、临床分期程度（χ2= 5.664，P = 0.017）、淋巴结转移（χ2=7.015，P = 0.008）相关。然而，CXCL11 和 CXCR3与患者的年龄、性别、肿瘤直径的大小均无关，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。

表2 CXCL11和CXCR3的表达与口腔鳞癌临床病理参数的关系Table 2.Relationship between the Expression of CXCL11 and CXCR3 and the Clinicopathological Parameters of Oral Squamous Cell Carcinoma

2.5 OSCC组织中CXCL11和CXCR3 表达的相关性

67例口腔鳞癌组织中，CXCL11阳性表达有46例，表达率为68.7%，CXCR3阳性表达50例，表达率为74.6%。Spearman相关性分析检验显示：r＝ 0.271，P = 0.026，二者的表达可能存在相关性。

2.6 CXCL11和CXCR3的表达与OSCC患者5年生存期情况

随访2015年1月至2017年12月期间诊治的31位患者，肿瘤未发生复发、转移的存活病例共13例，其中CXCL11阳性表达有7例，CXCR3阳性表达有8例；复发或死亡病例共18例，其中CXCL11阳性表达14例，CXCR3阳性表达有15例。结合免疫组化实验结果进行Kaplan-Meier 生存分析（图 3、4），结果表明：OSCC患者较短的生存期可能与 CXCL11、CXCR3阳性表达有关（HR = 4.456，P = 0.016；HR = 3.579，P = 0.036）。

图3 CXCL11表达与口腔鳞癌患者生存期分析Figure 3.CXCL11 Expression and Survival of Patients with OSCC

图4 CXCR3表达与口腔鳞癌患者生存期分析Figure 4.CXCR3 Expression and Survival of Patients with OSCC

3 讨 论

机体内免疫细胞受到多种不同细胞因子的调控，CXCL11与CXCR3的结合能诱导这些免疫细胞迅速浸润病变区域［6-7］。CXCL11经靶细胞分泌后，与表达于活化的T细胞、B细胞和NK细胞表面的CXCR3特异性结合，诱导细胞靶向迁移和免疫反应，在感染、自身免疫疾病和肿瘤免疫中发挥重要作用［8］。大量研究证实二者在多种恶性肿瘤中表达上调，朱晓斌［9］观察到CXCL11和CXCR3在晚期非小细胞肺癌组织中表达升高。在一项关于结直肠癌的研究中，也发现二者与肿瘤的发生存在较强的相关性［10］。本实验通过在GEO数据库下载GSE30784微阵列数据，观察到CXCL11在OSCC组织中的表达显著上调，与正常组织相比差异具有统计学意义（LogFC = 3.545，P ＜ 0.001）。免疫组化实验结果显示，在OSCC组织中，CXCL11和CXCR3的阳性表达率分别为 68.7%（46/67）和 74.6%（50/67），与正常组织中的表达情况32.1% （9/28）和39.3%（11/28）相比，表达率明显增加，差异具有统计学意义（P ＜ 0.001）。与王伊婷［11］在小鼠动物模型上取得的实验结果相似。在肿瘤生长过程中，CXCL11和CXCR3可以通过招募Th细胞、MDSCs和调节性T细胞，参与肿瘤的构建［12］。因此，作者认为CXCL11、CXCR3的表达上调可能与OSCC的发生存在一定的关联。

CXCL11与CXCR3的结合，具有促进肿瘤血管的生成、募集肿瘤细胞进行定植的能力，通过这样的方式可以促进卵巢癌［13］、多形性胶质母细胞瘤［14］、胆囊癌［15］等肿瘤的侵袭和淋巴结转移。本实验对生物信息学数据进行GO富集分析，继而绘制GO富集散点图，发现CXCL11富集于细胞侵袭和细胞迁移，表明CXCL11可能参与了OSCC的转移过程。结合免疫组化结果分析CXCL11、CXCR3与OSCC临床病理之间的关系，发现二者的表达与肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移之间有相关性，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05） ，而与患者年龄、性别、肿瘤直径的大小均无关，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。因此，本课题组猜想 CXCL11、CXCR3的过表达可能与促肿瘤作用相关（例如促进细胞增殖、趋化、侵袭和转移等），并最终导致不良结局的出现。

上皮间充质转化是肿瘤早期转移的关键步骤，这一过程中CXCL11和CXCR3的特异性结合起到了驱动作用［12］。Nazari等［16］发现，通过对 CXCL11-CXCR3轴进行干预，可以抑制膀胱癌的血管生成，导致肿瘤组织发生退化。对于大肠癌的一项研究发现，癌相关成纤维细胞分泌过表达的CXCL11，上调CXCR3，CXCL11-CXCR3的相互作用可激活PI3K/AKT通路，PI3K和AKT1磷酸化水平升高，导致癌组织中E-钙粘蛋白减少、波形蛋白增多，肿瘤的迁移和侵袭得到促进［17］。在本实验中，可以在OSCC组织中观察到CXCL11和CXCR3的过表达可能存在相关性（r = 0.271，P = 0.026）。因此，本课题组推测在OSCC发生的早期，对CXCL11-CXCR3轴进行干预，可能会对肿瘤的血管生成产生抑制作用，干扰肿瘤的侵袭和转移。

大量研究表明CXCL11和CXCR3的表达与癌症患者的预后相关，如卵巢癌［18］、黑色素瘤［19］和结直肠癌［10］， CXCL11 和 CXCR3 过表达的患者预后较差，可能是由于CXCL11-CXCR3轴通过 STAT和PI3K/AKT途径，激活了PD-L1，有助于抗肿瘤免疫逃逸作用。本研究结果显示，在OSCC组中，CXCL11阳性患者，出现复发和死亡的时间短于CXCL11阴性表达的患者（HR = 4.456，P = 0.016），CXCR3阳性患者的健康生存期也同样短于CXCR3阴性表达患者（HR = 3.579，P = 0.036），CXCL11 和CXCR3的过表达可能增加了OSCC的复发或死亡风险，对预后产生不利的影响。综上所述，OSCC的形成、侵袭、淋巴结转移，及不良临床病理分型和预后，可能与CXCL11、CXCR3的过表达存在一定的关联性。CXCL11和CXCR3作为OSCC早期检验、预后判断的标志物具有一定的可行性。本课题组后续将增加样本总量，并构建OSCC细胞模型，通过分别抑制细胞系中CXCL11和CXCR3的表达，从而验证二者在OSCC侵袭、迁移中所起到的作用，并探索其作用机制，同时考虑增加对放化疗术后患者的随访与研究。

本研究发现，趋化因子CXCL11与其受体CXCR3可能与OSCC的发生、发展、侵袭和转移有关。本实验前期采取生物信息学手段进行备选基因的筛查，有助于高效地完成目标基因的定位，继而采用免疫组化的方式分析其表达情况。有望为OSCC早期发现、诊断、治疗探寻新的诊疗方向，进而降低口腔鳞癌的发病率，减轻患者家庭及整个社会的经济负担，具有一定的社会效应。综上，CXCL11及CXCR3有望成为OSCC治疗新的靶点，不仅能够为早期OSCC的诊断及治疗提供重要的实验证据，而且也能够为靶向治疗的研究提供新思路。

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