免疫原性细胞死亡在口腔肿瘤中的初步机制*

曾宇祺，郭丽娟，杨森

563000 贵州 遵义，遵义医科大学口腔医学院/附属口腔医院 口腔颌面外科（曾宇祺、郭丽娟、杨森）；629000 四川 遂宁，遂宁市中心医院 口腔颌面外科（曾宇祺、郭丽娟、杨森）

头颈部癌症是全球最常见的癌症类别之一［1］，其中由人类乳头状病毒、吸烟或饮酒诱发相关的口腔癌病例正在增加［2］。口腔癌中超过90%来源于鳞状组织，称口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），是口腔中最常见的恶性肿瘤［3］。近年来，免疫治疗在对抗癌症细胞方面起着重要作用，据文献报道，不同治疗手段刺激口腔肿瘤细胞后，不仅可将肿瘤细胞杀死，而且可在其表面表达多种抗原信号分子，恢复肿瘤细胞的免疫能力，呈现一种针对死亡细胞宿主的适应性抗肿瘤免疫形式，即免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）［4］。ICD 诱导剂可引导口腔肿瘤细胞发生应激、自噬和坏死等活动，使肿瘤细胞释放多重抗原分子，发生免疫性死亡［5］。有研究表明，Ⅰ型诱导剂（如蒽环类、他汀类抗癌药物）在临床较为常见，可间接参与内质网（endoplasmic reticulum，ER）活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成，触发轻微ER 应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），致肿瘤细胞发生 ICD［6］；Ⅱ型诱导剂［如光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）、高静水压或溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）］在临床应用较少，可直接作用于肿瘤细胞，触发强烈ERS，导致蛋白质不能或错误折叠，此类蛋白累积后可激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）［7］，而后进入 ICD 过程。

在口腔肿瘤细胞ICD过程中，各种损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）表达上调，DAMPs暴露或释放出来，以“find me”或“eat me”的信号调节不同的免疫反应，促进抗原呈递细胞和/或吞噬细胞的成熟和活化，参与免疫抗原呈递［8］。ICD诱导剂作用口腔肿瘤细胞时DAMPs表达的情况包括：（1）钙网蛋白（calreticulin，CRT）暴露到细胞表面；（2）热休克蛋白（heat shock protein，HSP）转位和Ⅰ型干扰素（typeⅠ interferon，IFNⅠ）分泌；（3）高迁移率族蛋白B1（high mobility group box protein B1，HMGB1）中晚期释放；（4）三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）释放（图 1）。未成熟树突状细胞（dendritic cells，DCs）上的模式识别受体与以上信号结合，未成熟DCs变成熟DCs，进而吞噬凋亡肿瘤细胞，并将其与主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ）和成本刺激分子（CD83/86）一起呈递给CD8+T细胞，特异性激活细胞毒性 T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）；另外，肿瘤细胞分泌的细胞因子招募天然杀伤（natural killer，NK）细胞参与调控适应性免疫应答发生［9-10］。

图1 ICD诱导剂作用口腔肿瘤细胞时DAMPs表达的情况Figure 1. DAMPs Expression When ICD Inducers Act on Oral Tumor Cells

1 口腔肿瘤ICD时释放DAMPs的机制

1.1 ERS

当口腔肿瘤细胞受到“侵袭”时，ER在内外界因素“压力”下发生“保护性反应”，此时细胞内蛋白质因凝集障碍导致折叠浓度下降，激活UPR适应和防御机制，消亡肿瘤细胞启动ERS以维持内部稳定［11-12］。ERS的常见诱因有缺氧、酸中毒、营养剥夺等外在因素，以及致癌活化、遗传改变、释放能力恶化等内在因素［13］。肿瘤细胞释放的可溶性信号因子如细胞外囊泡、蛋白质或乳酸可将原生细胞与骨髓来源细胞建立联系，引起传播性ERS（transmissible endoplasmic reticulum stress，TERS），并以此联系细胞的凋亡过程［14］。在口腔肿瘤方面，李若焓等［15］研究发现，ERS状态的OSCC癌细胞可诱导小鼠胰岛素瘤MIN6细胞出现TERS并引起胰岛β细胞应激，抑制胰岛素合成。

研究显示，ER主要通过三类感受器激活UPR的防御反应：（1） 蛋白激酶RNA样ER激酶（protein kinase RNA-like ER kinase，PERK）。 作 为 ROS 调控的ERS臂和UPR膜感受器之一，PERK可导致eIF2α的磷酸化，抑制蛋白质生成［16-17］。活化转录因子 4（activating transcription factor 4 ， ATF4）［18］和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein， CHOP）［19］是 ER 应激诱导口腔肿瘤细胞ICD的关键因素，同样促进细胞凋亡的还有 DNA 损伤诱导基因（GADD153）［20］。综上，PERK/ ATF4通路激活其下游的凋亡信号因子CHOP/ GADD153表达，促进肿瘤细胞发生ICD；（2）肌醇需要跨膜激酶/内切酶（inositol requires transmembrane kinase/endonuclease enzymes， IRE1）通路。作为一种ER 膜I型跨膜蛋白，IRF1可介导X盒结合蛋白1诱导UPR，促进细胞生存，但IRF1过表达也会促进口腔肿瘤细胞的凋亡。IRF1活化后，其携带的酶位点与肿瘤坏死因子受体相关因子 2（TNF-receptor-associated factor 2，TRAF2）和凋亡信号因子调节激酶 1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）共 同 形 成 ER 外 膜 上 的 IRE1-TRAF2-ASK1 复合体。上述复合体可激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，JNK）、P38和有丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化，诱导CHOP的表达，形成IRE1/CHOP通路或下游通路，介导肿瘤细胞发生 ICD［21］；（3） 活化转录因子 6（activating transcription factor 6， ATF6）。ATF6 是细胞 ER 膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，ERS 使ER腔结构结合免疫球蛋白（BIP，也称为GRP78）从 ATF6上分解，在ERS条件下，BIP与ER应力传感器无法正常结合，从而促进蛋白质折叠［22］。激活的ATF6进入胞核与核转录因子（NF）Y结合，再与启动子 ERSE（ER stress response element）元件结合形成 ATF6-（NF）Y-ERSE复合体，该复合体进而诱导包括CHOP在内的 ER应激基因的转录表达，形成ATF6/CHOP通路，介导肿瘤细胞凋亡［23-24］。

1.2 CRT暴露

CRT是一种可溶和高度保守的ER分子伴侣，具有Ca2+稳态、MHCⅠ内外组装等功能［25］。化疗或放疗等治疗手段作用肿瘤细胞ICD的早期，ERS状态可致CRT大量转移到细胞质膜外部并暴露，释放“eat me”信号，被DCs识别和结合，或在CD47和MHCⅠ等细胞共同刺激下杀伤肿瘤细胞［26-27］。Sankaya等［28］测量小鼠 OSCC MOC1和 MOC2细胞用X射线和质子辐照后CRT在胞膜上的水平，发现免疫信号CRT表达的基线水平相对较高。

研究显示，CRT主要以三种机制暴露在口腔肿瘤细胞的表面：（1）ERS。CRT暴露于细胞主要依赖于PERK介导的真核细胞起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α， eIF2α）磷酸化反应。ICD诱导剂的处理能激发PERK/eIF2α及其下游的信号通路，区别在于半胱氨酸天冬氨酸蛋白8（cysteinyl aspartate specific proteinase 8， caspase8）或 UPR 的ATF4感受器。在长期ERS下，eIF2α持续活化和ATH4的表达增加，导致CHOP通过各种信号途径诱导细胞凋亡。综上， CRT可通过一定途径在细胞膜上或胞膜外暴露，其包括PERK/eIF2α/caspase8通路、PERK/eIF2α/ATF4通路及其下游CHOP/caspase3通路；（2）线粒体介导细胞凋亡。在ERS持续作用下，caspase级联激活（如caspase8），口腔肿瘤细胞发生凋亡紧密联系着BAP31和Bcl-2家族蛋白（Bax和Bak），随蛋白的上调或下调而发生相应改变［29］；（3）ER-高尔基体囊泡转运。CRT 可与囊泡或质膜相关蛋白（VAMP1、SNAP23等）紧密结合，以囊泡形式［30］从ER转运到高尔基体，再转运到细胞膜上（图 2）。

图2 口腔肿瘤ICD时CRT暴露到细胞表面的机制Figure 2.Mechanisms of CRT Exposure to the Cell Surface during ICD in Oral Tumors

1.3 HSP家族转位

HSPs是一组特异性蛋白家族，根据分子量递增 可 分 为 sHSP（small HSP，分 子 量 12～43 kDa）、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110 等亚类成员。HSPs主要保护口腔肿瘤细胞免受环境应激损伤，也可通过促进血管生成［31］和抑制细胞凋亡介导ICD，但其释放相当被动，且在不同肿瘤中的具体机制尚未完全明确［32］。有文献认为，HSPs发挥免疫作用可能与T细胞辅助因子Th1增加有关，HSP70在Th1比例大时发挥更强的肿瘤免疫效应［33-34］。HSPs可使受损蛋白恢复正常，抵御危害并保护细胞存活和适应外界环境变化［35］；另外，HSPs与胞质内特异性肿瘤抗原肽结合和/或胞膜上MHCⅠ分子收到HSPs信号形成活化的肿瘤抗原复合物，激活CTL，发挥抑制口腔肿瘤作用。在ERS下，HSP70/90可以通过Fas/caspase8通路参与抗口腔肿瘤细胞凋亡过程，当压力持续刺激，HSP70/90又可以介导Bcl-2蛋白家族的促凋亡信号作用［36］。

1.4 IFNⅠ分泌

IFNⅠ是一种低分子蛋白质或糖蛋白，具有免疫调节、抗病毒复制及抗细胞增殖等功能。IFNⅠ 可在应对各种刺激产生的自身免疫性疾病中传导增强，也可能潜在靶向相关 STING信号通路。在口腔肿瘤细胞ICD时，IFNⅠ分泌可激活DCs上的TLR3信号通路，与IFNⅠ自分泌IFNα或旁分泌IFNβ受体相配合，协同增强抗肿瘤免疫力［37-38］。

1.5 HMGB1释放

HMGB1蛋白是HGB含量最多的亚类，可在口腔肿瘤ICD时主动释放或被动呈递到细胞外，促使未成熟 DCs成熟，增加 CD40、CD80、MHC Ⅱ等细胞的表达。研究显示，在ICD中晚期释放的HMGB1可与多种信号体配合作用，如与糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）结合［39］。HMGB1参与口腔肿瘤ICD的途径可通过JNK/P38/MAPK通路或介导非典型核因子B（noncanonical nuclear factor κB，NF-κB）信号，促进口腔肿瘤细胞浸润和转移或血管生成、细胞炎性反应［40］。同时，HMGB1可在胞膜上和细胞外作用DCs表面受体TLR4和TLR2，抑制口腔肿瘤细胞生长［41］（图3）。

图3 口腔肿瘤ICD时HMGB1释放的机制Figure 3.Mechanisms of HMGB1 Release during ICD in Oral Tumors

1.6 ATP释放

ICD过程发展到晚期可促进由危险信号驱动的胞外 ATP（extracellular adenosine triphosphate，eATP）的运输。在eATP参与口腔肿瘤ICD的过程中，eATP与其关键性感受器DCs表面的受体P2X7（离子型）或P2Y2（代谢型）相互结合，触发免疫原性信号，分泌炎症介导因子IL-6、IL-1β、IL-12，导致ATP不能发送“find me”信号，阻断ICD介导吞噬细胞的招募和聚集，进而抑制肿瘤细胞自噬力及增强免疫功能［42］。eATP 是成熟 DCs激活 CD4+、CD8+T 细胞和NK细胞所必需的［43］，若eATP在细胞外被CD39和CD73水解为腺苷，腺苷的水平增加会抑制T细胞和NK细胞极化过程，从而促进口腔肿瘤细胞的发展与转移（图4），因此，抗口腔恶性癌症的免疫治疗诱导肿瘤发生ICD有eATP释放的参与［44］。当化疗药物或光动力疗法作用口腔肿瘤细胞时，细胞发生自噬早期释放ATP，或通过PERK调节分泌ATP和依赖PI3K激酶晚期释放eATP［45］。作为DAMPs之一，ATP释放可在ICD过程早期发生［46］，值得注意的是，eATP可在ICD晚期甚至全程到胞外发挥作用［47］。ATP何时释放存在争议，ATP释放机制可能因化疗诱导ICD的过程而变得不同，需要进一步的实验去论证。

图4 口腔肿瘤ICD时eATP释放的机制Figure 4.Mechanisms of eATP Release during ICD in Oral Tumors

1.7 膜联蛋白 1（annexin1，ANXA1）释放

ANXA1是膜结合蛋白超家族的一员，具有多基因、Ca2+调节和磷脂依赖等特性，研究表明，ANXA1的调控解除与肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药性有关，或可作为特定癌症的肿瘤抑制因子生物标志物［48］。Lin等［49］早先发现有ANXA1核染色的OSCC患者的总生存期明显缩短，用肝细胞生长因子处理的口腔癌SAS细胞可以诱导ANXA1从细胞质向细胞核转位。近来研究发现，ANXA1在体外抑制OSCC细胞的增殖和侵袭，转化生长因子β1/表皮生长因子诱导的上皮-间质转化在OSCC细胞中被ANXA1逆转，说明ANXA1可作为OSCC细胞的潜在肿瘤抑制基因［50-51］。

2 口腔肿瘤治疗中ICD诱导剂的应用

用于治疗口腔肿瘤的I型诱导剂，如蒽环类、抗生素类、铂类药物和紫杉醇等化疗药物，可通过抑制DNA修复和复制、阻碍胞质或跨膜相关蛋白生成等机制特异性诱导CRT暴露以及ATP、HMGB1、HSPs等释放［52-53］。蒽环类化疗药物在急性髓性白血病、心血管疾病临床治疗中广泛应用，但在头颈部和口腔颌面癌症鲜有研究［54-55］，这说明抗口腔肿瘤免疫治疗有望取得进一步发展。近年来，抗生素类化疗药物平阳霉素（pingyangmycin，PYM）处理后的舌鳞癌CAL27细胞发生了CRT由胞内至胞膜上暴露，且HMGB1分泌量增加，证明PYM可以诱导口腔鳞癌 ICD 发生［56］；Park等［57］研究采用基于铂的化疗药物奥沙利铂（oxaliplatin，OXA）和顺铂（cisplatin，DDP）联合处理人头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）细胞，证明OXA和DDP联合可增加HNSCC细胞ICD过程中CRT、HSP70和HMGB1的释放来抑制细胞生长；化疗药物可抑制生长周期，以此促进肿瘤细胞凋亡，Nakakaji等［58］通过共价联合一种磁化的紫杉醇（paclitaxel，PTX）偶联物处理口腔癌细胞，发现其可诱导细胞周期G2/M阻滞和细胞凋亡，但其在诱导肿瘤细胞发生ICD的领域尚未明确指出，有待深入研究。

用于诱导口腔肿瘤细胞凋亡的Ⅱ型诱导剂主要有PDT、OVs等。PDT使用光敏剂靶向作用增生活跃的肿瘤部位，在给予特定波长的光照后，细胞内的药剂会产生破坏性较强的ROS，导致肿瘤细胞死亡。Nasrin等［59］采用叶酸和姜黄素设计PDT光敏剂组合来产生双光子NIR，发现该光敏剂组合可触发ROS，增强口腔癌细胞凋亡OVs可直接针对肿瘤细胞并致其溶解凋亡，并具有靶向性、免疫调节性和修饰肿瘤微环境的能力。Saravanan等［60］研究溶瘤HSV-1病毒通过细胞融合或内吞作用进入OSCC细胞核中复制，引发程序性细胞死亡、细胞坏死、自噬细胞死亡与的相互作用。然而，能否准确将OVs靶向注入到口腔肿瘤细胞仍是一个待解决的问题，需要进一步研究其抗肿瘤免疫应答的应用。

3 总结与展望

在口腔肿瘤临床治疗与ICD机制中，ICD诱导剂作用于口腔肿瘤细胞使细胞表面高表达CRT、ATP、HSPs、HMGB1、IFNⅠ等引起机体免疫反应的抗原分子，提高DCs识别肿瘤细胞的能力，激活DCs对肿瘤的攻击，促使炎性因子释放，从而达到更理想的抗肿瘤免疫疗效。ERS和UPR已成为各种人类恶性肿瘤的重要靶点，可由此发展免疫靶向药物介导口腔肿瘤发生ICD ，增加ER靶向递药的研究。

各种类型的ICD诱导剂揭示了药物、化疗、高温以及溶病毒等手段诱导口腔肿瘤ICD的DAMPs上调和实现体内抗种肿瘤免疫反应的能力。Wang等［61］研究表明溴结构域蛋白BRD4抑制剂JQ1通过诱导ICD发生在舌鳞状细胞癌中表现出治疗潜力，表明从ICD角度研究口腔肿瘤患者的免疫治疗作用在国内逐渐受重视。目前有望利用免疫原性治疗方式与当前和新型免疫治疗方案的组合，开发出高效的治疗体系，增强肿瘤治疗效果，改善现有临床口腔肿瘤治疗策略。然而，口腔肿瘤细胞ICD的相关分子机制中的确切通路还有待进一步探索，相关药物的应用还需要更多长期的前瞻性研究和随机对照研究来进一步验证。

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