肿瘤坏死因子?基因启动子376 位点基因多态性与脓毒症急性肾损伤及死亡的关系

刘凤琪，唐坎凯，徐巍，褚利红，朱冰楠

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应，急性肾损伤（AKI）是其常见严重并发症，研究表明脓毒症合并AKI 患者即使采用连续肾脏替代治疗，90 d 病死率仍在50%以上[1]。AKI 出现多与炎症介质失控性释放及肾小管上皮细胞损伤相关，而肿瘤坏死因子（TNF- ）为脓毒症合并AKI核心致炎因子，主要由巨噬细胞分泌，产生最快，达到高峰时间最早，且能刺激其他促炎因子如IL-1、IL-6、IL-8 等产生[2-3]。TNF- 的编码基因位于HLA Ⅲ类基因区内，TNF-多个位点具有多态性，而基因多态性与许多疾病的发生、发展有关[4]。有学者表明308 位点的GA、AA基因型与中心静脉导管相关脓毒症合并多器官功能障碍综合征（MODS）的发生、发展相关[5]。而关于TNF- 基因启动子376 位点基因多态性的研究较少，其在脓毒症合并AKI 中的作用仍存在一定争议。基于此，本研究探究TNF- 基因启动子376 位点基因多态性与脓毒症合并AKI 及死亡的关系，以期为临床治疗提供参考，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2020 年1 月至2022 年1 月在湖州市第一人民医院就诊的脓毒症患者90 例，纳入标准：符合脓毒症诊断标准[6]，年龄＞18 岁。排除标准：（1）有手术史；（2）存在尿毒症、肾移植者；（3）妊娠或哺乳期患者；（4）炎性肠病患者；（5）伴有血液学疾病患者；（6）入院前已存在AKI。按照是否合并AKI[7]，分为脓毒症合并AKI组（58 例）和未合并AKI（Non-AKI）组（32 例）。本研究经湖州市第一人民医院医学科研与临床试验伦理委员会同意。

1.2 方法 TNF- -376 位点基因分型检测：（1）取研究对象静脉血3 ml，置于EDTA抗凝真空采血器中，分离单个核细胞，盐析法提取、纯化DNA，置于－30 ℃低温冰箱保存备用。（2）采用PCR 技术检测基因型，使用TaqMan SNP 基因分型分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,United States），上游引物：5’-CCCCTCCCAGTTCTAGTTCTATCTT-3’，下游引物：5’-CCTATTGCCTCCATTTCTTTTG-3’，使用探针为FAM-CTGTCTGGAAATTAGAAG（376 A），VIC-CTGTCTGGAAGTTAGAAG（376 G）。PCR 反应体系总体积为10l，含10×Buffer 1l，PCR 引物各5l、dNTP mixture 0.2l、Taq 聚合酶0.5 U、100 ng 模板DNA，加足够无菌蒸馏水。反应条件：95℃预变性10min，变性95℃15s、60 ℃退火60 s，60 ℃延伸5 min，共40 个循环。PCR数据在Applied Biosystem 7500 RT-PCR ABI 上进行分析，TNF- 基因启动子376 位点基因型分为GG型、GA 型、AA 型。

1.3 观察指标（1）收集一般资料：年龄、性别、体质量指数（BMI）、脓毒症死亡风险评分、收缩压及舒张压；（2）比较脓毒症合并AKI 组及Non-AKI 组的TNF--376 位点基因分型；（3）比较不同基因分型患者的生存情况：观察30 d，TNF- -376 位点不同基因分型患者的生存情况。

1.4 统计方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t 检验；计数资料以率（%）表示，采用2检验；生存分析采用Kaplan-Meier 法和Log-Rank 检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组年龄、性别、BMI、脓毒症死亡风险评分、收缩压及舒张压差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组TNF- -376 位点基因型和等位基因频率比较 脓毒症合并AKI 组与Non-AKI 组的GG、GA、AA型分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05），两组等位基因携带率比较，差异亦有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组TNF- -376 位点基因型和等位基因频率比较 例（%）

2.3 不同基因型患者的生存曲线分析 TNF- -376位点为GG 型患者的总生存率为50.00%，高于GA型及AA 型的26.92%、12.50%（Log-rank2=6.128、6.107，均P ＜0.05），见图1。

图1 脓毒症组中TNF- -376 位点不同基因型患者的生存情况

3 讨论

脓毒血症是ICU 常见因感染引起的危急症，病情凶险，可引起休克、多器官组织衰竭，是危重症患者死亡的主要原因之一[8]。肾脏是脓毒症的易损器官，据估计，高达50%～75%的严重脓毒症患者在病程中出现AKI，而AKI 的出现会增加患者病死率[9]。炎症反应是脓毒症合并AKI 进展的主要原因之一，而TNF- 作为其主要启动因子，在内毒素诱导的炎症介质的瀑布样释放中起着重要作用[10-11]。有研究表明机体受刺激后TNF- 水平存在差异，而这种差异是基因决定的[12]。因此探究TNF- 基因启动子376位点基因多态性，可能为未来治疗提供新的靶点。

TNF- 是一种细胞因子，能够产生多种表型及功能效应，其过量产生会降低脓毒症患者的免疫功能及其他细胞功能，在急性炎症状态及脓毒症中能够预测疾病严重程度及并发症的发展，而一些研究表明TNF- 水平与TNF- 基因表达的多态性相关[13]。TNF- 基因启动子区域中238、308、376、489 位点均与脓毒症中TNF- 产生有关联[14]。本研究发现，脓毒症合并AKI 组GA、AA 型的比例高于Non-AKI组，两组等位基因携带率差异亦有统计学意义。这提示TNF- -376 位点的基因多态性与脓毒症合并AKI 的发生相关。分析这可能是由于TNF- 可以通过刺激间充质干细胞（MSCs）增加细胞因子的释放，参与肾组织中中性粒细胞的趋化、聚集及激活，并释放大量氧自由基，进而导致肾小管上皮细胞的损伤，使得脓毒症合并AKI，加重机体器官负荷[15]。但也有研究表明TNF- -376 位点的基因多态性与AKI的发生无关。这可能与患者的遗传分布、种族及样本量的不同有关[16]。本研究对患者生存时间的分析发现，TNF- -376 位点为GG型患者的总生存率为50.00%，高于GA型及AA型的26.92%、12.50%，这提示TNF--376 位点为GG型的生存率较高，GA、AA型可能为患者预后不良的重要预测因子。

目前序贯器官衰竭估计评分是用于评估脓毒症、AKI等疾病损伤程度的相对精确的量表，具有客观、数据易收集的特点，但是对于脓毒症合并AKI的早期预测存在一定的局限性，特异性较差，且其计算繁复、难以快速使用[17]。本研究从基因层面考量，发现TNF- -376 位点的GA、AA 型患者脓毒症合并AKI 发病率高，且预后较差，这提示需尽早对GA、AA 型患者采取预防措施、避免AKI 的出现。当然本研究也存在一定不足：研究为单中心研究，样本量较小，且在样本的选择上存在一定偏颇，今后将联合多中心，扩大样本量，并将选择不同地区人群，研究多个TNF- 基因启动子位点，以提高研究的准确性及丰富性。

综上所述，TNF- -376 位点的基因多态性与脓毒症合并AKI 的发生有关，TNF- -376 位点为GG型的生存率较高，临床需多关注GA、AA 型患者的情况，及时进行治疗，改善其预后。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 刘凤琪、朱冰楠：实验操作、论文撰写；徐巍、褚利红：数据整理、统计学分析；唐坎凯：研究指导、论文修改、经费支持