GGT1 基因SNP 预测乳腺癌术后EC-T 化疗方案血液系统毒性临床研究*

沐 宇，彭 瑞，梁兴忠，石祥奎，吴昕雨，胡书群，黄 亭△

（1. 江苏省徐州市妇幼保健院·徐州医科大学附属徐州妇幼保健院，江苏 徐州 221000； 2. 徐州医科大学附属医院，江苏 徐州 221000）

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万女性患者确诊。早期原发灶经手术切除后，辅以化学药物治疗（简称化疗）是消除术中残余和全身散在癌细胞（血源性转移）的有效手段，可显著降低复发概率［1］，但必须警惕化疗引起的毒性反应。相关研究表明，遗传因素是增加化疗毒性的重要原因之一［2］。其中，单核苷酸多态性（SNP）是最常见的遗传学改变。谷氨酰转肽酶1（GGT1）基因位于人类第22 号染色体，GGT 通常分布于导管和腺体表面，在肝、肾、胰腺等分泌活跃的细胞上表达较多，GGT 对于维持机体内谷胱甘肽（GSH）和半胱氨酸的稳态至关重要［3］。GSH作为抗氧化剂，能中和氧自由基，保护细胞免受氧化应激，GGT 依赖的促氧化反应能调节细胞的增殖和凋亡，在肿瘤细胞的生长过程中扮演重要角色［4］。GGT 在多种恶性肿瘤中表达异常，促进了肿瘤细胞的增殖，并影响了患者的化疗耐药和预后［5-6］。表柔比星联合环磷酰胺序贯紫杉醇类制剂（EC-T）方案是临床广泛采用的乳腺癌术后辅助化疗的一线方案，但同时会引起许多药品不良反应，其中骨髓抑制是其剂量限制性药品不良反应，常表现为白细胞减少、中性粒细胞减少，制约着化疗剂量和化疗周期的实施，影响肿瘤的缓解率与治愈率［7］。为此，本研究中探讨了乳腺癌患者GGT1基因SNP 与术后EC - T 化疗方案血液系统毒性的相关性，以期为乳腺癌术后化疗患者血液毒性的预防提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：年龄＞18岁且3代以内亲属无乳腺癌病史；经手术治疗，术后病理检查确诊为原发浸润性乳腺癌，至少有1个可测量病灶；美国东部肿瘤协作组（ECOG）评分≤2 分，卡氏（KPS）评分＞75 分；化疗前各项临床指标均达标（血红蛋白≥80 g/ L，白细胞计数≥1.5 ×109/L，血小板计数≥100×109/L，丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、血肌酐均不超过正常上限值的1.5 倍，肌酐清除率≥60 mL/ min，心电图示心律正常）；术后接受EC-T序贯化疗。

排除标准：已出现远端转移或合并其他恶性肿瘤；患乳腺癌，且既往有化疗、放射治疗或伽马刀等治疗史；妊娠期或哺乳期；对本研究中拟用药物过敏；血液系统疾病或其他严重疾病，包括严重糖尿病、重度高血压，6个月内出现过心力衰竭，以及有心肌梗死史等。

病例选择：收集徐州市妇幼保健院乳腺外科2021年1月至12月接受EC-T 化疗方案的乳腺癌术后患者60例。本研究方案经医院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 基因测序及分型

采集患者外周静脉血2 mL，采用Ezup 柱式血液基因组DNA 抽提试剂盒（生工生物工程＜上海＞有限公司，简称生工生物公司）提取DNA，严格按试剂盒说明书操作，产物置- 20 ℃冰箱中保存。选取rs5751901 和rs2017869 两个SNP 位点，以rs5751901 上游引物5′ -ACCATAGGCAGAGTAAGGACCTG - 3′和下游引物5′ - AGCAGCCAAGGAAGGCCAA - 3′，rs2017869 上游引物5′-GATGGCAGTTCGGGATGTCATGC-3′和下游引物5′ - ACACCAGGAAGGCTGTGCAAAC - 3′进行聚合酶链式反应（PCR），且目的片段长度均为201 bp，反应体系为10 × Buffer 5 μL（含MgCl2），dNTP 5.0 μL（10 mmol/L），上下游引物各2.5 μL（10 μmol/L），Taq DNA 聚合酶1.0 μL（5 U/μL），DNA 模板9.0 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环；72 ℃5 min终止反应。

取PCR 扩增产物5 μL，加1 μL Loading Buffer 混合，加样于2.0%琼脂糖凝胶中进行水平电泳（电压80 V，时间40 min）DNA Marker 为碱基量标准。观察在201 bp处出现条带且其他位置处无干扰条带即为PCR 扩增成功。将PCR 产物进行基因测序（生工生物公司）确定基因型。

1.3 EC-T 序贯化疗方案

均以21 d 为1 个周期。第1～4 个周期，第1 天予注射用盐酸表柔比星（山东新时代药业有限公司，国药准字H20123260，规格为每支10 mg）90 mg/ m2和注射用环磷酰胺（山西普德药业股份有限公司，国药准字H14023686，规格为每支200 mg）600 mg/m2；第5～8 个周期，周期第1 天均予紫杉类药物，包括多西他赛注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20020543，规格为每支20 mg）75 mg/m2；或紫杉醇注射液（扬子江药业集团有限公司，国药准字H20053001，规格为每支30 mg）175 mg/m2；或注射用紫杉醇（白蛋白结合型，江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20183378，规格为每支100 mg）260 mg/m2；或注射用紫杉醇脂质体（南京绿叶制药有限公司，国药准字H20030357，规格为每支30 mg）135～175 mg/m2。

1.4 资料收集

收集患者的人口学资料（包括年龄、体质量指数＜BMI ＞、个人疾病史、吸烟史、家族史等）和临床资料（包括TNM 分期、分化情况、淋巴结转移情况、化疗方案等）。记录患者的基因型分布及化疗过程中各项毒性反应（包括中性粒细胞减少、白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少）发生情况，并根据世界卫生组织（WHO）抗癌药物毒性分级标准分级。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计学软件分析。计量资料以X±s表示，行t检验；计数资料以率（%）表示，行χ2检验。以χ2拟合优度检验验证各SNP 基因型是否符合Hardy -Weinberg 平衡；以χ2检验比较各基因型与不良反应间的关系；以Logistic 回归分析比值比（OR）及其95%置信区间（CI）表示相对危险度（以野生型默认风险为1，分析杂合突变型和纯合突变型的相对风险）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GGT1 SNP 基因型分布

GGT1rs5751901 位点共检出2 种等位基因（C，T）和3 种基因型（TT 型、TC 型、CC 型），rs2017869 位点共检出2 种等位基因（C，G）和3 种基因型（GG 型、GC 型、CC 型），基因型分布见表1［基因频率=该基因的总数/（该基因的总数+ 等位基因的总数），其中频率最低的为最小等位基因频率］，均符合Hardy - Weinberg 平衡定律（P＞0.05）。表明样本来自同一孟德尔遗传群体，具有群体代表性。

表1 GGT1 SNP基因型分布Tab.1 Distribution of genotypes of GGT1 gene with SNP

2.2 GGT1 SNP 与药物毒性严重程度的相关性

出现2 级及以上中性粒细胞减少、白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少的患者分别有43例（71.67%）、48例（80.00%）、34例（56.67%）、8例（13.33%）。

Logistic 回归分析结果显示，对于rs5751901 位点，与TT型+TC型患者比较，CC型患者出现2级及以上中性粒细胞减少的风险显著降低（P＜0.05）；与TT 型+CC 型患者比较，TC 型患者出现2 级及以上中性粒细胞减少的风险显著升高（P＜0.05），但经年龄、BMI、月经状态等因素校正后差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2 GGT1 SNP与中性粒细胞减少严重程度的相关性Tab.2 Correlation between SNP of GGT1 and severity of neutropenia

对于rs5751901 位点，与TT 型+ TC 型患者比较，CC 型患者出现2 级及以上白细胞减少的风险显著降低（P＜0.05）。详见表3。

表3 GGT1 SNP与白细胞减少严重程度的相关性Tab.3 Correlation between SNP of GGT1 and severity of leukopenia

对于rs2017869 位点，与GG 型和GG 型+ GC 型患者比较，CC 型患者出现2 级及以上血红蛋白减少的风险显著降低（P＜0.05）。详见表4。两位点与血小板减少严重程度无显著相关性。详见表5。

表4 GGT1 SNP与血红蛋白减少严重程度的相关性Tab.4 Correlation between SNP of GGT1 and severity of hemoglobin reduction

表5 GGT1 SNP与血小板减少严重程度的相关性Tab.5 Correlation between SNP of GGT1 and severity of thrombocytopenia

3 讨论

GGT 能将细胞外的GSH 水解为谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸，使细胞回收利用氨基酸［3］，GGT/ GSH 为细胞抗氧化防御系统的重要组成部分［8］。GGT 抗氧化和促氧化功能间可能存在平衡，当细胞GGT 过表达或在氧化还原因子的存在下，促氧化作用可能更占优势，其促氧化活性有助于肿瘤组织保持持续的氧化应激状态，并参与细胞增殖/ 凋亡等肿瘤进程，以及产生耐药［9］。在乳腺癌中，GGT 高活性与预后不良因素（雌激素受体阴性、淋巴结转移）显著相关，GGT 阴性的乳腺癌患者预后更好，对于原发性转移性乳腺癌患者，治疗前血清高GGT 水平与较低的5 年总体生存率显著相关［10］。研究表明，血清GGT水平受环境因素和遗传因素双重调控，且其遗传力为61%［11］。全基因组关联研究（GWAS）已在不同种群中证实了GGT1SNP 与血清GGT表达水平间的相关性，SNP 会影响GGT 在组织和血清中的水平，最终影响肿瘤的发生、发展和化疗效果［11-12］。

目前，关于GGT1SNP 的研究多集中在rs5751901，rs2017869，rs8135987 这3 个位点。KHRUNIN 等［13］在卵巢癌化疗患者中研究了GGT1与药物毒性反应的关系，发现在接受顺铂化疗期间，携带rs5751901 TT型的患者发生肾毒性的风险有增加趋势。但鲜有乳腺癌术后化疗中GGT1SNP和化疗毒性是否存在相关性的研究。EC-T方案为乳腺癌术后常用化疗方案，其引起的血液毒性备受临床关注，同时药物基因组学的发展也为EC - T的不良反应研究提供了帮助［14-15］。本研究中，患者化疗后出现的主要血液毒性是中性粒细胞减少、白细胞减少、血红蛋白减少和血小板减少。Logistic 回归分析显示，中性粒细胞减少和白细胞减少主要与rs5751901位点有关，血红蛋白减少主要与rs2017869位点有关，血小板减少与此两位点可能无关。携带rs2017869 CC 型对于乳腺癌术后患者经EC-T 化疗后出现的血红蛋白减少为保护因素；携带rs5751901 CC 型的患者化疗后出现中性粒细胞减少和白细胞减少的风险更低，携带rs5751901 TC 型的患者化疗后出现中性粒细胞减少的风险更低。因此，对于携带rs5751901 TT 型+ TC 型患者，化疗前需严格把握化疗对血液指标的要求，同时化疗过程中应密切监测血常规，警惕3度、4度中性粒细胞减少和白细胞减少出现。MELZER 等［16］研究发现，rs5751901 的CC 型与血清GGT 水平相关，每个少见等位基因会增加0.21个标准差增量，证实了GGT1SNP 与血清GGT 水平间的相关性。根据本研究结论可进一步推论，血清GGT 高水平的患者出现3 度、4 度中性粒细胞减少和白细胞减少的风险较小，这一相似结论在鼠模型中也被证实［17］。不可否认的是，EC-T 化疗方案由于药物自身的特点，引起的血液毒性普遍较严重，而单一的SNP位点对其影响可能有限，或存在假阳性/假阴性的结果，尚需扩大样本进一步验证。

综上所述，乳腺癌术后EC-T 化疗患者GGT1SNP和化疗血液毒性存在一定相关性，GGT1SNP 在血液毒性的预测和尽早干预方面具有潜在价值。本研究中的患者化疗后血小板减少发生率较低，可能与样本量偏小有关，下一步将扩大样本量对上述结果进行证实，并进一步在细胞水平揭示GGT1SNP 对GGT 蛋白功能的影响及其机制。