强力枇杷露抑菌效力的影响因素考察

张静，熊乐乐，章瑛，张春华，熊蔚

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

强力枇杷露具养阴敛肺，镇咳祛痰的功效，用于久咳劳嗽，支气管炎等的治疗。原标准收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第二册WS3-B-0442-90［1］，现行标准为《中国药典》2020年一部［2］。强力枇杷露是由枇杷叶、罂粟壳、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷脑等七味中药和蔗糖制成，含适量枸橼酸、香精和苯甲酸钠，含蔗糖量为60%（g/mL），为高浓度蔗糖水溶液。

强力枇杷露因服用方便、吸收快速、效果显著、病人接受程度高等特点而获得广泛使用，大多为多剂量包装［3］。根据《中国药典》2020 年版四部［4］通则0116 糖浆剂项下规定，糖浆剂在制剂处方确定之初，该处方的抑菌效力就应符合抑菌效力检查法。强力枇杷露处方中使用的抑菌剂为苯甲酸钠，处方含量为0.25%。而《中国药典》2020 年版与2015 年版在抑菌效力检查法上最大的不同在于：除了考虑不同种类型的菌落，包括革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌），革兰阴性菌（大肠埃希菌、铜绿假单胞菌），致病酵母菌（白色念珠菌）和霉菌（黑曲霉），还特别提出若需要，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株，例如高浓度糖的口服溶液还应选用鲁氏酵母作为试验菌株。鲁氏酵母是最常见的耐高渗酵母，能在高浓度的蔗糖溶液中生长，但目前为止尚未发现鲁氏酵母对人类存在致病性。

因此，本研究拟参照《中国药典》2020 年版四部通则1121 抑菌效力检查法对不同企业的不同有效期、不同pH 值、不同水活度的强力枇杷露抑菌效力进行考察，除常见的五株菌外另选用鲁氏酵母进行抑菌考察［5］。同时制备缺罂粟壳的阴性样品，使用枸橼酸调节pH、蔗糖调节水活度，考察样品在不同pH、不同水活度情况下，对所添加的抑菌剂苯甲酸钠抑菌效力的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器

YXQ-LS-50S Ⅱ型高压蒸汽灭菌器（上海博讯实业医疗器械有限公司）；SW-CJ-2D 净化工作台（苏州净化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；PYX-DHS 细菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；KB400 霉菌培养箱（BINDER 公司）；HH.W21.600S 电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）；FE20K pH 计和Sartorious T601-L 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Aqualab 4TEV 水分活度测定仪和PE20K 酸度计（METTLER TOLEDO）。

1.2 菌种

鲁氏酵母（Saccharomyces rouxii）购自国家菌种保藏中心，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）、白色念珠菌（Candida albicans）均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 培养基与试剂

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（青岛海博生物技术有限公司），胰酪大豆胨琼脂培养基（北京三药科技开发有限公司），沙氏葡萄糖液体培养基（北京陆桥技术股份有限公司），沙氏葡萄糖琼脂培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司），苯甲酸钠（批号：100433-201702，含量 99.7%，中国食品药品检定研究院），蔗糖（批号：20201105，分析纯，廊坊鹏彩精细化工有限公司），薄荷脑（批号：20210317，含量99.0%，江西华豫源生物科技有限公司），枇杷叶、百部、白前、桑白皮、桔梗等饮片均购自市售连锁药店。

1.4 样品

强力枇杷露9 批次，来源于日常抽检及市场采购。具体样品信息详见表1。

表1 强力枇杷露样品信息

2 方法与结果

2.1 自制样品和菌悬液的制备

2.1.1 自制样品的制备 取枇杷叶69 g、百部15 g、白前9 g、桑白皮6 g、桔梗6g 等五味药材饮片加水煎煮两次，每次加水2 L，煎煮2 h，合并药液，滤过，滤液浓缩至500 mL，加蔗糖600 g，加热至沸腾并保持20 min，静置1 h，滤过，加入用乙醇溶解的0.15 g 薄荷脑，搅拌混匀，静置，滤过，并加水至1 000 mL。取上述溶液9 份，每份100 mL，使用枸橼酸调节不同pH，加入蔗糖调节不同水活度。添加抑菌剂苯甲酸钠（浓度以酸计）使浓度分别为0.15%、0.20%、0.25%。具体数据详见表2。

表2 自制样品信息及抑菌实验结果

2.1.2 菌悬液的制备 取鲁氏酵母、白色念珠菌、黑曲霉分别接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，25 ℃培养48 h，作为新鲜培养物；鲁氏酵母、白色念珠菌新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至浓度分别为106cfu/mL 和107cfu/mL 的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物继续培养1 周后用含0.05 %聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含孢子数107cfu/mL 的孢子悬液。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌分别接种至胰酪胨大豆肉汤培养基中35 ℃培养24 h，作为新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至浓度均为108cfu/mL 的菌悬液。

2.2 水活度测定

分别取“1.4”和“2.1.1”项下市售和自制强力枇杷露在25 ℃条件下用水活度仪测定水活度，每份样品平行测定3 次，取平均值。结果见表1、表2。

2.3 方法适用性试验

对9 批次强力枇杷露进行方法适用性试验。经过验证，不同企业的强力枇杷露均可使用以下方法进行计数，六株菌的回收率均在0.8 以上，符合《中国药典》2020 年版四部通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的要求。在该方法下，能有效检出强力枇杷露中的含菌数。具体方法见表3。

表3 强力枇杷露微生物方法学

2.4 抑菌效力测定

每批样品取6 支试管，每支试管加入样品9.9 mL，再分别加入金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲁氏酵母、白色念珠菌、黑曲霉0.1 mL，充分混匀，使试验菌在样品中分布均匀，接种后的样品中染菌量为105～107cfu/mL。接种后样品避光，置25 ℃培养箱中。9 批次市售强力枇杷露和9 批次自制样品在接种后0 d、14 d、28 d 分别取样，对菌落数进行计数。抑菌效力判断标准参照《中国药典》2020 年版四部通则1121 抑菌效力检查法中口服制剂：细菌在接种后14 d 下降3 个lg 值，至28 d 时无增长；真菌在接种后14 d 下降1 个lg 值，至28 d 时无增长。

2.5 抑菌实验结果

2.5.1 市售样品的抑菌效力 9 批次强力枇杷露均通过抑菌效力挑战实验，在接种后14 d 细菌和真菌均为0，lg值均下降5～7，且在28 d时细菌和真菌均为0，lg 值均未增加。

2.5.2 自制样品的抑菌效力 抑菌效力考察结果显示，9 批次自制样品共有5 批次通过抑菌效力挑战实验。苯甲酸钠（以酸计）添加量0.25%时，3 批次自制样品均通过挑战实验；添加量0.20%时，其中2 批次通过挑战实验（pH6.5，水活度0.967 1 时1 批次未通过挑战实验）；添加量0.15%时，3 批次自制样品均未通过挑战实验。具体详见图1。

图1 自制样品9批次对6株菌的影响

3 讨论

3.1 不同有效期对抑菌效力的影响

同一企业3 批次不同有效期（生产3 个月内1 批、距离保质期一年1 批、保质期3 个月内1 批）强力枇杷露均通过抑菌效力考察，且3 批次样品在14 d内需氧菌和真菌均未有生长。说明强力枇杷露在保质期内抑菌剂浓度变化不大，抑菌效力受有效期影响不大。

3.2 pH 值对抑菌效力的影响

9 批次不同pH 值的市售样品，均通过抑菌效力考察。但是在自制样品中，pH 值与苯甲酸钠的浓度对抑菌效力的影响较为明显。当阴性样品pH低于4.5 时，苯甲酸钠（以酸计）添加浓度为0.20%即可通过抑菌效力检查，表明抑菌剂的抑菌效力受pH 影响较大。提示在苯甲酸钠（以酸计）添加浓度在一定范围时，pH 对液体制剂中的苯甲酸钠的抑菌效力起主导作用，抑菌剂苯甲酸钠的有效抑菌取决于其非解离状态，与制剂的pH 息息相关。苯甲酸钠的最佳使用pH 在2.5～4.5 之间，pH 大于5几乎无抗菌活性。抑菌体系中抑菌剂苯甲酸钠的抑菌活性与自制样品的pH 成反比关系，一定范围内，制剂的pH 越低，苯甲酸钠抑菌效果越好［6-7］。

3.3 水活度对抑菌效力的影响

口服液体制剂的水活度较高，且根据处方工艺的不同，不同企业不同制剂水活度相差也较大。本研究中几批次强力枇杷露的水活度在0.95～0.97 之间，随着水活度的增加，不同菌的生长速率也有很大增长，尤其是在对制剂pH 做出调整之后，水活度对制剂的抑菌效力影响很大。能否利用水活度的概念来控制中药制剂中微生物的增长是当前的研究热点［8-9］。表4 为常见6 株菌生长所需的最低水活度。

表4 菌株生长所需的最低水活度

苯甲酸钠是药品中常用的安全、低毒、高效抑菌剂，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、致病酵母菌和霉菌均具有良好的抑制作用。根据以上实验结果，强力枇杷露的抑菌体系的构建较为合理，能较好地抵御微生物污染风险。不过该抑菌体系依然存在可以优化的地方，结合药物的理化性质在一定pH 范围内控制水活度，可以减少抑菌剂的添加量以达到更好的抑菌效力。