基于网络药理学和分子对接探析通冠益心方防治冠心病作用机制

黄飞 祝丹 陈启兰

冠心病（coronary heart disease，CHD）为临床常见病、多发病，我国现有CHD 患者约1139 万，城乡居民CHD 死亡率持续上升[1]，给公共卫生和经济带来沉重负担。西医规范治疗存在药物不耐受或疗效不佳，介入等方式也存在血运重建不完全或微血管功能障碍等问题[2]。中医药治疗CHD 历史悠久，疗效显著，有着广泛的临床应用价值。通冠益心方（Tongguan Yixin Prescription，TGYXP）为浙江中医药大学附属杭州市中医院院内协定方，主要应用于气虚血瘀型CHD 患者，能有效缓解胸闷胸痛、气短乏力等心绞痛症状。TGYXP 由加味丹参饮和消瘰丸化裁而成，由黄芪、丹参、赤芍、檀香、浙贝、玄参、水蛭、三七粉等8 味中药组成，方中黄芪善益气健脾补肺，大补宗气，气旺以助血行，且免祛瘀伤正之虞，丹参、檀香活血祛瘀，行气止痛，气血并调，浙贝、玄参清热化痰，软坚散结，标本兼顾，赤芍清热凉血，散瘀止痛，水蛭破瘀血而不伤新血，性迟缓善入而擅消坚积，三七粉化瘀不伤正，止血不留瘀，诸药相合，共奏益气活血、通络散结之功。该方临床疗效突出，但作用机制尚不明确。网络药理学以系统层次和生物网络的整体层面为切入点[3]，与中医药学的整体论相合，为揭示中药复方复杂机制开辟新思路。本研究依据网络药理学和分子对接，发掘TGYXP 防治CHD 的作用机制。

1 材料与方法

1.1TGYXP 有效成分筛选和靶标预测 经TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/index.php）数据库，检索并筛选TGYXP 组成药物的有效活性成分和作用靶标。分别检索“黄芪”“丹参”“赤芍”“檀 香”“浙 贝”“玄 参”“三七”，筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%，药物类药性（DL）≥0.18，筛选出7 味中药主要活性成分和靶标。

因TCMSP 数据库未收录水蛭，查阅相关文献[4]，利用Excel 建立水蛭活性成分表，由Pub Chem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取SMILES结构，再将SMILES 结构输入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库，物种选择“人类”，筛选出可能性＞10%的蛋白作用靶标。最后在Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库将靶蛋白转化为标准基因名。

1.2CHD 的靶标筛选和交集靶标获取 在GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，检索“Coronary Heart Disease”，筛选可信度较大的基因，获取CHD 靶标。利用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）网站，对TGYXP 和CHD 靶标取交集映射获取两者交集靶标。

1.3“中药复方-活性成分-潜在靶标”网络构建用Excel 软件VLOOKUP 函数将TCMSP 数据库获取的活性成分与上述两者交集靶标取映射，再整理为Network、Type 表格，经Cytoscape 3.9.1 软件（https://cytoscape.org/）制作“中药复方-活性成分-潜在靶标”图。

1.4蛋白质互作（PPI）网络构建 将TGYXP 治疗CHD 的交集靶标导入STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）行PPI 分析。蛋白质物种选择“homo sapiens”，最低相互作用阈值设置为“high confidence（0.900）”，隐藏游离靶标，其余参数默认，导出TSV格式数据，构建交集靶标PPI 网络图[5]。

1.5关键治疗靶标筛选 将上述TSV 数据导入Cytoscape 3.9.1 软件，利用Tools 工具栏中Network Analyzer 插件行网络拓扑学分析。筛选度值（degree），中介中心性（betweenness centrality），紧密中心性（closeness centrality）≥平均值的节点为关键靶标[5]，并构建关键靶标网络图。

1.6核心靶标GO 功能及KEGG 通路富集 经DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对复方疾病交集靶标开展GO 功能、KEGG 通路富集分析。获取TGYXP 防治CHD 的生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）及信号通路信息。并在微生信网站，绘制排名靠前的GO 功能及KEGG 通路富集气泡图。

1.7TGYXP 活性成分和关键靶标分子对接 基于上述研究结果行分子对接验证，选取度值较高的活性化合物槲皮素、木犀草素、水蛭素B 为配体与核心靶标STAT3、AKT1 为受体进行分子对接。槲皮素、木犀草素、水蛭素B 三种化合物的二维结构在Pub-Chem 数据库下载，再利用ChemBio 3D Ultra（https://www.chemdraw.com.cn/xiazai.html）软件将其转化为三维结构；核心靶标STAT3、AKT1 的蛋白结构在PDB（https://www.rcsb.org/）数据库下载，将配体及受体利用AutoDock Tools（https://autodock.scripps.edu/）软件进行分子预处理，而后在PyMOL（https://pymol.org/2/）软件完成分子对接[6]。

2 结果

2.1药物活性成分与靶标筛选 经TCMSP 数据库筛选出活性化合物黄芪20 个，丹参65 个，赤芍29个，檀香3 个，浙贝7 个，玄参9 个，三七8 个，蛋白作用靶标黄芪462 个，丹参931 个，赤芍158 个，檀香100 个，浙贝70 个，玄参68 个，三七253 个；综合文献信息和数据库筛选，获取水蛭活性化合物59个，蛋白作用靶标1398 个。共筛选出48 种TGYXPCHD 交集靶标对应活性成分，见表1～2。

表1 非水蛭中药对应活性化合物

表2 水蛭对应活性化合物

2.2CHD 相关靶标筛选和交集靶标获取 GeneCards数据库检索到CHD 致病基因7936 个，筛选Relevance score＞25 的基因共592 个。在微生信网站将TGYXP 668 个药物靶标与CHD 592 个疾病靶标取交集，最终得到114 个交集靶标，见图1。

图1 交集靶标、核心靶标图

2.3制作“中药复方-活性成分-潜在靶标”图 将整理的Network、Type 表格导入Cytoscape 3.9.1 软件制作“中药复方-活性成分-潜在靶标”图（见图2）。筛选出有效治疗活性成分黄芪9 种，丹参11 种，赤芍5 种，檀香1 种，浙贝2 种，玄参3 种，三七5 种，水蛭18 种，共有活性成分4 种。网络拓扑学分析排名靠前的活性成分依次是槲皮素、木犀草素、水蛭素B、十六碳烯酸甲酯、山奈酚等。该网络共有171 个节点，422 条边，四边形代表靶标，圆形代表中药，六边形代表单药相关活性成分，三角形代表药物共有活性成分，V 形代表疾病，线段连接表示节点间相关作用关系。

图2 中药复方-活性成分-潜在靶标图

2.4PPI 网络构建和关键靶标筛选 在Cytoscape 3.9.1 软件利用Network Analyzer 插件行网络拓扑分析，得出节点的平均度值为7.524752475，平均中介中心性为168.534653465，平均紧密中心性为0.043 279131；最终排名在平均值以上的靶标有37个。度值、中介中心性、紧密中心性均靠前的靶点有STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK1、MAPK14 等，见图1。

2.5GO 功能富集分析 经David 数据库对复方疾病交集靶标行GO 功能富集分析。共富集到960 条GO 条目，包含773 条生物学过程（BP），111 条分子功能（MF）和76 条细胞组分（CC）；排名从前往后BP依次为基因表达的正向调控、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、信号转导；MF 依次为蛋白质结合、同种型蛋白质结合、蛋白质同二聚化活性；CC 依次为质膜、胞质溶胶、细胞外空间等。见图3。

图3 GO 功能及KEGG 通路富集气泡图

2.6KEGG 通路富集分析 KEGG 通路共富集到153 条通路，主要为脂质和动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、癌症通路等途径。纵轴代表名称，横轴代表基因比率（Gene Ratio）。气泡越大表明该途径基因富集数量越多，气泡颜色偏红色显示富集程度越显著，即P值越小，见图3。

2.7分子对接结果 分子对接显示，STAT3 与槲皮素、木犀草素、水蛭素B 最低对接能分别为-8.20、-8.60、-6.30 kJ/mol；AKT1 与槲皮素、木犀草素、水蛭素B 最低对接能分别为-7.30、-9.50、-6.00 kJ/mol。评价分子对接强弱一般依据成分与靶标的结合能及形成氢键数量，结合能越低，氢键数量越多，分子结合越稳定，两者间作用可能性就越大，见图4。

图4 成分-靶标分子对接图

3 讨论

3.1CHD 中医机理及TGYXP 来源 CHD 在中医范畴当属“胸痹”“心痛”，《金匮要略》中归纳其病因病机主要为“阳微阴弦”，“阳微”为心气不足、心阳不振、心血亏虚和心阴亏损，“阴弦”指气滞、寒凝、血瘀、痰浊，本病病机关键是本虚标实，正虚在内为本，阴邪干犯为标。不通则痛、不荣则痛是其主要环节。CHD 中医证候常为本虚标实、虚实夹杂的复合证型，本虚多见气虚（67.17%），标实多有血瘀（77.89%）、痰浊（43.97%）[7]。根据“脉络积”学说[8]，CHD 的主要病理基础动脉粥样硬化，其病位在脉络-血管，因气血津液运化失常，气滞痰浊血瘀等积聚内生于脉，结合以上特点及临床实际，依据益气活血、通络散结之法研制出TGYXP，该方丸药缓图，固护脾胃，虫药通络，主要用于治疗CHD 心绞痛、经皮冠状动脉介入术后患者。

3.2关键活性成分的研究“中药复方-活性成分-潜在靶标”网络筛选出排名靠前的活性成分依次是槲皮素、木犀草素、水蛭素B、十六碳烯酸甲酯、山奈酚等。槲皮素能降低稳定型冠心病NF-κB 的转录活性[9]，抑制炎症指标分泌，并能抗血小板聚集[10]，减轻三酰甘油的生成[11]；木犀草素可激活PI3K-Akt 信号通路，抑制内质网应激诱导的细胞凋亡、线粒体功能、氧化应激等途径来减轻心肌缺血再灌注损伤[12]；水蛭素能抑制血小板聚集以抗凝血[13]，并能抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖、表型分化、迁移、分泌等多种细胞生物学过程[14]。

3.3核心靶标的研究 PPI 网络筛选出排名靠前的核心靶标依次是STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK1、MAPK14 等。多个STAT3 通路影响动脉粥样硬化[15]，IL-6/JAK2/STAT3 通路在动脉粥样硬化内皮细胞功能障碍和免疫细胞分化中起重要作用。IL-10/JAK/STAT3 通路激活通过其抗炎作用导致病灶大小、免疫细胞积累和病灶细胞模式表型的改变，另外可激活PIAS1 和SOCS-3 等途径影响STAT3 激活来干预动脉粥样硬化发生[16]；AKT1 为血管生成调节的关键信号分子，主要调节细胞的生存、新陈代谢和增殖等，活化后的AKT1 可激活血管内皮一氧化氮合成酶（eNOS），产生一氧化氮，进而发挥促血管扩张和增强血流量效应[17]。

3.4功能及通路富集的研究 GO 功能富集表明，TGYXP 防治CHD 可能通过基因表达的正向调控、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、信号转导等；KEGG 通路富集表明，可能通过脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路。PI3K-Akt 在细胞增殖、血管生成、自噬等层面起重要作用，是细胞内重要的信号转导通路[18]。MAPK 信号通路属于炎症通路，该通路激活后会分泌各种炎性因子而发挥炎性效应，在心绞痛、心肌缺血等疾病治疗中有重要作用[19]，生理剪切力可维持内皮细胞稳态，病理剪切力则会导致内皮功能障碍促进动脉粥样硬化[20]。

综上所述，本研究运用网络药理学和分子对接筛选出TGYXP 防治CHD 的主要活性成分及核心靶标，初步阐述了涉及的主要生物过程及信号通路，从理论层面验证了TGYXP 可通过多成分、多靶点、多通路的协同效应来发挥作用。本研究局限性如下：检索筛选的数据库较单一，分析结果有待基础研究验证，未能反映药物剂量和浓度的影响。