酪氨酸激酶受体RON 和MET 在三阴性乳腺癌组织中的表达特征及临床意义

王国平 张筱荻 寿春晖

三阴性乳腺癌作为一种常见恶性肿瘤，严重威胁着女性的身心健康[1]。多种原癌基因的激活和抑癌基因的突变参与着三阴性乳腺癌发生发展的病理过程。酪氨酸激酶受体间质表皮转化因子（MET）和巨噬细胞刺激蛋白受体（RON）同属于MET 原癌基因家族[2]。已有研究表明，它们在包括大肠癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌等在内的多种癌症组织中都有异常的表达和激活[3-5]，这些异常改变导致了癌细胞的增殖、侵袭性增强，促进细胞凋亡和转移[6]。本研究探讨RON 和MET 在三阴性乳腺癌组织中的表达特征，比较RON 和MET 表达与三阴性乳腺癌临床病理关系，评价其作为三阴性乳腺癌患者病理诊断和预后判断的新型生物标志物的临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2011 年1 月至2018 年5 月在浙江中医药大学附属第二医院以及浙江大学医学院附属第一医院经病理诊断为三阴性乳腺癌并行手术治疗的130 例患者组织。临床资料包括患者人口统计学、肿瘤淋巴结转移（TNM）阶段、肿瘤分化和肿块大小等。将所有组织固定在10%甲醛缓冲液并包埋在石蜡中。该研究获得医院伦理审批（伦理审批编号：2017427-2）。

1.2主要试剂 抗RON 鼠单克隆抗体Zt/F2[7]由浙江大学传染病诊治国家重点实验室研制和惠赠，抗MET 的兔单克隆抗体EP1454Y（Abcam 51067，Abcam，USA），EnVision System 免疫组织化学染色试剂（K3468，Dako，Carpentaria，CA，USA）。

1.3免疫组织化学染色 5 μm 石蜡厚组织切片于60 ℃烤片2 h 后，经二甲苯和梯度浓度乙醇（100%、95%、75%、50%）脱蜡水化后，用3%H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶，1%BSA 封闭30 min。加抗RON 鼠单克隆抗体Zt/f2（1∶1000）或抗MET 兔单克隆抗体EP1454Y（1∶100），4 ℃反应过夜，PBS 洗4 次后，采用Envision System 二步法进行免疫组织化学染色和显色。最后组织片用苏木素复染，封片。

1.4结果评估 所有免疫组化染色切片，由两名病理科医师对切片进行检查、评分和成像。使用半定量系统确定RON 和MET 表达水平。该方法结合了目标蛋白的染色强度（0～3）和染色细胞比例（0～4 分）的分数，综合得分2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为中度阳性（++），＞5 分确定为强阳性（+++），并且积分≥4 分为过表达。细胞比例评分如下：0 分（＜5%），1 分（6%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%）和4分（＞75%）。染色水平评分如下：0 分（无染色），1 分（弱染色，浅黄色），2 分（中度染色，黄褐色）和3 分（强染色，棕色）。总分是通过将阳性比例得分和染色程度得分相加而确定。RON 和MET 两者都过表达的患者被认为共同过表达。

1.5统计学方法 应用GraphPad Prism 7 和SPSS 17.0 进行统计分析。使用χ2检验比较RON 和MET表达与临床病理特征之间的关系。总生存期（OS）计算从诊断到死亡或最后一次随访日期的时间。生存数据通过Kaplan-Meier 方法和对数秩检验进行分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1MET 和RON 在三阴性乳腺癌组织中的表达免疫组化染色显示，MET 和RON 主要表达在癌细胞的细胞质和细胞膜（见图1）。在129 例三阴性乳腺癌样本中，MET 阳性表达率为77.52%（100/129），其中弱阳性表达率为33.33%（43/129），中度阳性表达率为32.56%（42/129），强阳性表达率为11.63%（15/129），过表达率为44.19%（57/129）；RON 阳性表达率为72.87%（94/129），其中弱阳性表达率为34.89%（45/129），中度阳性表达率为24.03%（31/129），强阳性表达率为13.95%（18/129），过表达率为37.98%（49/129）。RON 和MET 共表达阳性率为59.69%（77/129），其中共同过表达为24.03%（31/129）。

图1 三阴性乳腺癌组织样品中RON 和MET 表达水平（免疫组化染色，×40，×200）

2.2MET 和RON 蛋白表达与三阴性乳腺癌患者临床病理的关系 结果显示，MET 蛋白表达与组织学分级存在相关性（P＜0.05），与年龄、肿块大小、临床分期、淋巴结转移无明显相关性（P＞0.05）。RON 蛋白表达与患者临床分期、组织学分级、远端转移、年龄、肿块大小、淋巴结转移均无明显相关性（P＞0.05），见表1。

表1 三阴性乳腺癌组织中MET 和RON 蛋白表达与临床病理参数间的关系（例）

2.3MET 和RON 在三阴性乳腺癌组织中的相关性结果显示，乳腺癌组织中MET 蛋白的分级表达与RON 蛋白的分级表达之间具有显著相关性（P＜0.05），见表2。

表2 MET 与RON 蛋白在三阴性乳腺癌中分级表达的相关性

2.4RON 及MET 的表达与三阴性乳腺癌患者总生存期的关系 对129 例患者进行生存分析，结果显示，RON 或MET 强阳性表达的患者相较于RON 或MET 非强阳性表达的患者的生存期明显缩短（P＜0.05），见图2。

图2 三阴性乳腺癌组织RON 或MET 表达水平与患者生存期的关系

3 讨论

MET 和RON 蛋白属于酪氨酸激酶受体家族，具有相似的结构[2，8]。MET 可以通过肝细胞生长因子被激活，使其自身磷酸化，然后将信号传入细胞核，促使细胞增殖和分化，包括发生形态转化、诱导细胞增殖、运动和侵袭等[9]。RON 属于MET 家族，特异性配体为人巨噬细胞刺激蛋白[6-7，10]。有研究证实，经配体活化的RON 亦可引发MET 转磷酸，反之亦然。并且，异常表达的RON 也可以与MET 形成异二聚体而活化，促进RON 的肿瘤生物学效应。由此可见，尽管配体不同，但它们在细胞信号通路中相互影响，具有协同作用[11]。我们研究结果也显示，在这129 例临床样本中二者的表达水平具有显著的相关性。

三阴性乳腺癌是一类复杂的、异质性的乳腺癌亚型，三阴即雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2 阴性。三阴性乳腺癌具有特殊的生物学行为，侵袭性强，且因为缺少靶向治疗的特定靶点，其复发的概率很高[12]。有研究显示，三阴性乳腺癌的发生发展过程中涉及多种原癌基因和信号通路，如P53、MYC基因、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）通路等的改变[13]。但其确切的发病机制仍在探索中。本文意在探索RON 和MET蛋白在三阴性乳腺癌病程进展中的作用。

免疫组化结果显示，在三阴性乳腺癌组织中RON 和MET 表达增加，RON 阳性表达可达到72.87%，而MET 的阳性率则更高，可达到77.52%，它们共同过表达率可以达到24.03%，即在三阴性乳腺癌患者中RON 蛋白高表达者亦会伴随着MET 蛋白的高表达。因而我们推测，在三阴性乳腺癌的发展过程中，RON 和MET 以异二聚体的形式对ERK、苏氨酸蛋白激酶（AKT）等信号通路进行激活，从而导致肿瘤细胞增殖转移、血管生成、化疗耐药等特性的改变。此外，经过统计，RON 或MET 强阳性表达患者的生存期明显缩短，我们认为联合检测RON 和MET，具有一项或共同强阳性表达的患者具有不良预后。而RON 和MET 蛋白表达与患者年龄、肿块大小、淋巴结转移等临床参数无明显相关性，与前期研究结果相符[6，9]。

不止在预后评估方面，越来越多的研究关注于RON 和MET 能否作为潜在的肿瘤治疗靶点[14-15]。我们也在另外一项研究中证实，利用小分子抑制剂共同抑制胰腺癌细胞系中RON 和MET 的表达，肿瘤细胞的迁移力和小鼠移植瘤模型的肿瘤体积均得到了很好的抑制，但仅针对MET 的抑制剂效果却很弱[16]。这可能是因为RON 在肿瘤形成和恶性进展中具有更重要的生物作用[15]，因而有研究认为RON 作为未来肿瘤治疗的靶点更具意义[13]。

综上所述，癌组织中RON 和MET 的异常高表达，可能参与了三阴性乳腺癌的发生发展及恶性化进展的病理过程。异常表达的RON 和MET 不仅是三阴性乳腺癌病理诊断的新型生物标志，同时也是潜在的抗癌药靶。