丁香酚对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌梗死保护作用

黄潇潇 黄连军

心肌梗死是由冠状动脉缺血而引起的心肌坏死，其急性期具有很高的死亡风险，而慢性期则以心室重构和心力衰竭为特征。研究表明，心肌缺血缺氧后会导致氧化应激反应过度激活，而受损心肌的氧化应激会进一步诱导心肌细胞凋亡，加重心脏功能障碍[1]。心肌细胞凋亡在整个心脏重塑过程中持续存在，并显著影响抗心肌缺血治疗疗效[2]。因此，抑制心肌细胞凋亡对于减轻心脏功能障碍具有重要意义，是修复受损心脏和治疗缺血性心脏病的关键[1]。丁香酚是丁香的主要活性成分之一，具有抗炎、抗纤维化、抗凋亡、抗氧化和抗癌等多种药理作用[3]。此外，丁香酚包合物可通过抑制核因子κB 信号通路的活化起到抗心肌缺血再灌注损伤的作用[4]。而丁香酚对急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的保护作用及其机制仍然未知。本研究探讨了丁香酚对异丙肾上腺素（ISO）诱导的AMI 模型大鼠的潜在保护作用及其可能作用机制，旨在为治疗AMI 提供思路。

1 实验材料

1.1动 物 40 只健康SPF 级雄性Wistar 大鼠（250～280 g）购自杭州子源实验动物科技有限公司，动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0004。由浙江海康生物饲养，实验饲养室许可证号：SYXK（浙）2021-0005。饲养条件：温度（22±2）℃，12 h 光暗环境交替，大鼠自由进食饮水，实验开始前适应性饲养1 周。动物实验方案经温州医科大学伦理委员会审批（伦理批号：wydw2023-0094）。

1.2主要药物、试剂和仪器 丁香酚（纯度≥98%，批号246719）和ISO（批号1351005）购自美国Sigma公司；肌酸激酶（CK，批号210116）、肌酸激酶同工酶（CK-MB，批号210415）、乳酸脱氢酶（LDH，批号210117）、心肌肌钙蛋白T（cTnT，批号210716）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号210125）、白介素-6（IL-6，批号210307）、丙二醛（MDA，批号210107）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号201202）、Annexin VFITC 细胞凋亡检测试剂盒（批号C1062）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）试剂（批号D025-1）购自南京建成生物工程研究所。RIPA 裂解液（批号89901）、BCA 蛋白定量分析试剂盒（批号23227）、增强型化学发光（ECL）试剂盒（批号32106）购自美国Thermo Fisher Scientific 公 司。iNOS（批 号ab178945）、Cleaved Caspase 3（批号ab2302）和β-actin 抗体（批号ab8226）及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（批号ab150077）购自美国Abcam 公司。多导生物记录仪（型号：BL-420F）购自成都泰盟科技有限公司、离心机（型号：HC-2518R）购自安徽中科中佳科学仪器有限公司。

2 实验方法

2.1AMI 模型的建立与分组 40 只大鼠按随机数字表法分为五组：对照组、模型组、丁香酚低剂量组（1 mg/kg）、丁香酚中剂量组（10 mg/kg）和丁香酚高剂量组（100 mg/kg），每组8 只。丁香酚各剂量组予以相应剂量丁香酚灌胃，对照组和模型组给予等量的生理盐水灌胃，每日1 次，连续7 d。除对照组外，各组大鼠皮下注射100 mg/kg ISO，连续2 d，建立AMI 模型，以心电图ST 段抬高（即高于0.2 mV）为造模成功判断指标[5]，对照组注射等量生理盐水。

2.2心肌损伤指标测定 末次给药后，40 mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，切开腹腔，从下腔静脉采集血液标本，4 ℃下2500 r/min 离心10 min 后收集上清液，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）根据相应试剂盒说明测定血清CK、CK-MB、LDH 和cTnT 水平。

2.3氧化应激和炎症因子指标测定 取部分心肌组织、称重、加入0.5 mL 磷酸盐缓冲液，研磨后得到匀浆液，以2500 r/min 离心，收集上清液。使用ELISA法测定心肌组织中MDA、SOD、TNF-α 和IL-6 含量。

2.4梗死面积测定 TTC 染色用于评估心肌梗死面积[6]。大鼠安乐死后，取心脏置于-20 ℃冰箱中20 min，称重，切片（2～3 mm），在1% TTC 溶液中于37 ℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定24 h。梗死区为白色，正常为红色，Image J 软件用于分析梗死面积，心肌梗死率（%）=梗死区面积/总面积×100%。

2.5心肌细胞凋亡测定 各组取部分心肌组织，眼科剪剪成糜状，PBS 冲洗，加入1 mL 胰酶消化液，用移液器间断吹打消化组织，最后用1 mL 预冷PBS 冲洗终止消化，过滤，离心5 min 收集各组心肌细胞。按照凋亡检测试剂盒说明书，每组细胞用结合缓冲液重悬后，将细胞与5 μL Annexin-V-FITC 和5 μL 碘化丙啶（PI）染色剂避光孵育15 min。最后，使用FACS Calibur 流式细胞仪（Becton Dickinson）分析凋亡细胞。初次进行流式细胞仪检测时设置未染色、PI 单染和Annexin V-FITC 单染这3 个对照。

2.6Western blot 将心肌组织在冰上用含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解并匀浆。然后，将匀浆液在4 ℃下5000 r/min 离心15 min，取上清液，通过BCA 蛋白定量分析试剂盒测量蛋白浓度。将30 μg蛋白样品在10% SDS-PAGE 上进行电泳，随后转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭，加入一抗iNOS（稀释1∶1000）、Cleaved Caspase 3（稀释1∶500）和β-actin（稀释1∶1000）于4 ℃下孵育过夜，洗涤后，加入二抗于37 ℃下孵育1 h，用ECL 法进行化学发光。用Image J 软件对蛋白表达进行定量，β-actin 作为内参。实验重复3 次测量。

2.7统计学方法 应用SPSS 20.0 统计软件处理数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组内两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1各组大鼠血清心肌损伤指标含量比较 与对照组比较，模型组大鼠血清CK、CK-MB、LDH 和cTnT水平显著升高（P＜0.01），而中、高剂量的丁香酚可显著降低AMI 模型大鼠血清CK、CK-MB、LDH 和cTnT水平（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清心肌损伤指标含量比较（）

表1 各组大鼠血清心肌损伤指标含量比较（）

注：对照组为健康Wistar 大鼠，予生理盐水；模型组为AMI 模型大鼠，予生理盐水；丁香酚低剂量组为AMI 模型大鼠，予1 mg/kg 丁香酚；丁香酚中剂量组为AMI 模型大鼠，予10 mg/kg 丁香酚；丁香酚高剂量组为AMI 模型大鼠，予100 mg/kg 丁香酚；AMI 为急性心肌梗死；CK 为肌酸激酶；CK-MB 为肌酸激酶同工酶；LDH 为乳酸脱氢酶；cTnT 为心肌肌钙蛋白T；与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

3.2各组大鼠心肌组织梗死面积比较 与对照组比较，模型组梗死面积显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，丁香酚各剂量组大鼠梗死面积显著减少（P＜0.01）。见表2、图1。

图1 各组大鼠心肌组织梗死情况比较（2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色）

表2 各组大鼠心肌组织梗死面积及iNOS 蛋白表达比较（）

表2 各组大鼠心肌组织梗死面积及iNOS 蛋白表达比较（）

注：对照组为健康Wistar 大鼠，予生理盐水；模型组为AMI 模型大鼠，予生理盐水；丁香酚低剂量组为AMI 模型大鼠，予1 mg/kg 丁香酚；丁香酚中剂量组为AMI 模型大鼠，予10 mg/kg 丁香酚；丁香酚高剂量组为AMI 模型大鼠，予100 mg/kg 丁香酚；AMI 为急性心肌梗死；与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

3.3各组大鼠心肌组织iNOS 蛋白表达比较 与对照组比较，模型组大鼠iNOS 蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，丁香酚各剂量组iNOS 表达显著降低（P＜0.01）。见表2、图2。

图2 各组大鼠心肌组织iNOS 蛋白表达比较

3.4各组大鼠炎症因子含量比较 与对照组比较，模型组TNF-α 和IL-6 水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，中、高剂量丁香酚组可显著降低TNF-α和IL-6 水平（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠炎症因子和氧化应激指标含量比较（）

表3 各组大鼠炎症因子和氧化应激指标含量比较（）

注：对照组为健康Wistar 大鼠，予生理盐水；模型组为AMI 模型大鼠，予生理盐水；丁香酚低剂量组为AMI 模型大鼠，予1 mg/kg 丁香酚；丁香酚中剂量组为AMI 模型大鼠，予10 mg/kg 丁香酚；丁香酚高剂量组为AMI 模型大鼠，予100 mg/kg 丁香酚；AMI 为急性心肌梗死；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-6 为白介素-6；SOD 为超氧化物歧化酶；MDA 为丙二醛；与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

3.5各组大鼠氧化应激指标含量比较 与对照组比较，模型组MDA 水平升高，SOD 水平下降（P＜0.01）。与模型组比较，中、高剂量丁香酚可显著降低AMI 大鼠MDA 水平，上调SOD 水平（P＜0.01）。见表3。

3.6各组大鼠细胞凋亡水平比较 与对照组比较，模型组心肌细胞凋亡水平和Cleaved Caspase 3 表达水平显著升高（P＜0.01），而中、高剂量丁香酚能显著降低细胞凋亡和Cleaved Caspase 3 水平（P＜0.01）。见表4、图3。

图3 各组大鼠细胞凋亡水平比较

表4 各组大鼠细胞凋亡水平比较（）

表4 各组大鼠细胞凋亡水平比较（）

注：对照组为健康Wistar 大鼠，予生理盐水；模型组为AMI 模型大鼠，予生理盐水；丁香酚低剂量组为AMI 模型大鼠，予1 mg/kg 丁香酚；丁香酚中剂量组为AMI 模型大鼠，予10 mg/kg 丁香酚；丁香酚高剂量组为AMI 模型大鼠，予100 mg/kg 丁香酚；AMI 为急性心肌梗死；与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

4 讨论

丁香酚具有抗氧化和心脏保护活性，在临床治疗心血管疾病方面具有较大的开发价值[3]。ISO 是一种非选择性β 肾上腺素受体激动剂，可引起心脏过度刺激，导致缺血、严重氧化应激和炎症反应，从而导致AMI。本研究显示给予大鼠ISO 与心肌损伤有关，主要表现为AMI 诊断标志酶CK、CK-MB、LDH和cTnT 水平增加，此外，模型组心肌组织显示大面积梗死区，而丁香酚能显著改善大鼠梗死面积并降低AMI 诊断标志酶水平，提示丁香酚可能是临床应用中潜在的AMI 治疗药物。有研究表明，丁香酚可通过调节LDH、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、MDA和CK 来缓解心肌缺血再灌注损伤[4]，与本研究结果一致。

ISO 诱导的心肌损伤机制是多方面的，本研究通过氧化应激、炎症和心肌细胞凋亡等方面来研究其可能机制，并阐明丁香酚的可能保护机制。据报道，给予大剂量的ISO 可增加MDA 并降低SOD 水平，导致严重的氧化应激，并引起大鼠心肌坏死性损伤[7]。与之前研究一致，我们的数据显示在ISO 给药后显著增加MDA 水平并降低SOD 水平，而丁香酚在预防氧化应激引起的心肌损伤中有积极作用，这可能是其具有心脏保护作用的原因。先前的研究也表明，丁香酚具有很强的抗氧化和抑制脂质过氧化作用[4]。同时，受损心肌的氧化应激会进一步诱导心肌细胞凋亡[1]。在本研究中，丁香酚可改善AMI 模型大鼠中的细胞凋亡，说明丁香酚的抗氧化和抗凋亡作用对AMI 具有保护作用。

本研究中，促炎症细胞因子TNF-α 和IL-6 的表达增强提示ISO 诱导的心脏组织中炎症状态加重，而丁香酚处理减少了促炎症细胞因子TNF-α、IL-6 表达，与王娜等[4]结果一致。Ma等[8]研究表明，丁香酚能抑制脊髓损伤大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平，促进其功能恢复。此外，一氧化氮（NO）在心血管疾病的治疗中起着重要作用[9]。在AMI 中，各种心脏细胞中iNOS 的过度诱导，导致介导氧化应激、炎症活动和心肌损伤发展的NO 过度产生[10]，表现为作为氧化应激指标的MDA 显著增加及作为炎症介质的IL-6 和TNF-α 显著增加。本研究中，丁香酚处理可以中和iNOS 的异常诱导，降低组织iNOS蛋白表达水平，与前期研究报告类似[10-11]。

综上所述，丁香酚对ISO 引起的AMI 具有改善作用，其机制可能与调节iNOS、炎症和氧化应激有关。