基于公共数据库分析LDHA、LDHB 基因在肺腺癌中的表达及其预后

鲁伟 陈婷婷 姚轶敏

肺癌是全世界癌症相关死亡率的主要原因[1]。在肺癌患者中，约85%为非小细胞肺癌[2]。肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌中最常见的病理类型，由于其早期病理特征不明显、转移时间较晚、恶性程度较高，尽管治疗的手段和方法在不断进步，但患者5 年生存率仍不足20%[3]。如何更早地筛查和诊断LUAD，探索其驱动机制，找到可靠的生物标志物及判断预后具有重要临床意义。糖酵解代谢异常增强是肿瘤细胞的重要生物学特征之一。糖酵解过程中乳酸的产生可能促进肿瘤的发展[4]。乳酸脱氢酶（LDH）催化丙酮酸转化为乳酸的可逆反应，在肿瘤细胞糖酵解中起关键作用[5]。LDH 是糖酵解的关键酶，与231 种癌细胞的存活和增殖有关[6]。尽管多项研究报告LDH 与几种实体瘤的预后有关，但该过程的具体机制仍不清楚，可能与Warburg 效应有关[7]。本研究旨在运用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库、基因表达谱交互式分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库、人类蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库、Kaplan-Meier（KM）Plotter 网站、肿瘤免疫评估资源库（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）在线数据库、UCLCAN 数据库等工具，明确LDHA、LDHB 基因在LUAD 中的表达情况以及对其进行预后分析。

1 资料与方法

1.1获得相关数据 我们从TCGA 数据库下载了594 个样本（包括535 个LUAD 样本和59 个正常肺样本）的RNA 测序（RNA-seq）数据和相应的临床信息。通过TCGA 数据库找到LDHA、LDHB 基因在其中的表达情况。

1.2验证基因表达情况 GEPIA 是一个用来表达分析和交互分析癌症和正常基因的服务器，可通过单基因分析、癌种分析、多基因分析等方法得到LDHA、LDHB 基因在LUAD 癌组织及癌旁组织中的表达情况，进行表达水平的作图和生存分析。

UALCAN 数据库是一个交互式web 网站，可用于在线分析和寻找更多的癌症组学数据，可以进行miRNA 的差异分析、生存分析以及靶基因预测。本研究利用UALCAN 数据库分析LDHA/LDHB 表达和临床因素之间的相关性。

1.3分析诊断价值 通过“ggplot2”（用于可视化）进行表达差异分析，获得LDHA、LDHB 基因在LUAD组织与癌旁组织中的表达差异情况及LDHA、LDHB基因与患者临床资料相关性分析，包括肿瘤分期、年龄、性别、吸烟等。

使用pROC 包对LUAD TCGA 数据进行ROC分析，结果用ggplot2 进行可视化。pROC 包默认会对数据的结局顺序进行校正。利用受试者工作特征曲线（ROC 曲线），通过曲线下的面积（AUC）来确定不同标准的界限值下的疾病识别能力，判断LDHA/LDHB 基因对于LUAD 的诊断价值。

1.4预后相关性分析 使用survival 包进行比例风险假设检验并进行拟合生存回归，结果用survminer包以及ggplot2 包进行可视化。如果选用了最佳分组方法（best），则对应使用survminer 包中surv_cutpoint函数进行最佳分组cut-off 筛选。同时可以使用KM Plotter 数据库、HPA 数据库的预后模块进行预后价值判断的辅助验证。

1.5单基因GO 和KEGG 富集分析 通过“stat”R包（基础包）对关键基因进行单基因pearson 相关性分析，保留满足cor＞0.5，P＜0.05 阈值的相关性基因。通过“clusterProfiler”R 包（用于富集分析）和“ggplot2”R 包（用于可视化）对相关性基因进行GO注释和KEGG 通路分析。

1.6免疫浸润相关性分析 TIMER 是一个分析肿瘤浸润免疫细胞成分的软件，几乎涵盖了所有的癌症种类。基于高通量测序数据来分析肿瘤组织中免疫细胞的浸润情况，支持6 种常见免疫细胞的分析。通过TIMER 在线数据库进行免疫浸润分析，评估LUAD 患者关键基因的表达与浸润免疫细胞之间的关系。

1.7统计学方法 所有数据统计分析使用R version 4.0.2 软件。采用在线统计学分析数据，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1LUAD 患者LDHA/LDHB 表达增加 利用TCGA数据库中获得的数据来分析LUAD 患者LDHA/LDHB的mRNA 表达水平，发现与邻近正常组织的表达水平相比，LDHA/LDHB 在LUAD 患者中的表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）（见图1A）。与配对的癌旁组织相比，LUAD 患者LDHA/LDHB 的表达明显上升，差异有统计学意义（P＜0.01）（见图1B）。同时，基于HPA 数据库也发现LDHA/LDHB 在LUAD 中的蛋白表达，与正常肺组织相比，LDHA/LDHB 在不同抗体染色程度的LUAD 中的蛋白水平均有升高。

图1 LDHA/LDHB 在LUAD 中的表达

2.2LUAD 患者LDHA/LDHB 表达与临床相关性通过使用UCLCAN 在线工具，结合不同的临床参数来调查不同情况的LUAD 患者中LDHA/LDHB 的表达。首先从性别来看，与正常对照组相比较，LDHA/LDHB 在男性和女性LUAD 患者中的表达水平均显著增加（P＜0.05）（见图2A）。其次，不同肿瘤分期的LUAD 患者中均观察到LDHA/LDHB 表达明显上升（P＜0.05）（见图2B）。另外，根据淋巴转移状态，LUAD患者LDHA/LDHB 表达也随着淋巴结转移数增多而显著增加（P＜0.05），见图2C。

图2 LDHA/LDHB 在不同LUAD 患者中的表达

2.3ROC 曲线分析 通过TCGA 数据库中LUAD的表达谱数据绘制ROC 曲线分析其诊断价值，发现LDHA 可作为区分LUAD 与正常肺部组织生物标志物（AUC=0.952，95%CI：0.934～0.970），LDHB 在LUAD患者诊断中有一定的诊断价值（AUC=0.734，95%CI：0.693～0.775），见图3。

图3 LUAD 及邻近组织中LDHA/LDHB 表达的受试者工作特征曲线分析

2.4LUAD 患者LDHA/LDHB 预后相关分析 利用不同数据库得到的LDHA/LDHB 在LUAD 中的生存状况来进行预后分析。从包含LUAD 样本与正常相邻组织样本的GEPIA 数据库评估来看，LUAD 中LDHA/LDHB 的表达显著高于正常组织（见图4A）。此外，通过TCGA 数据库、KM Plotter 数据库的数据也证实了LDHA/LDHB 在LUAD 中存在着过表达。KM 生存曲线综合分析显示，在患病后100 个月内，LDHA/LDHB 表达较高的患者常存在着预后不良的情况（P＜0.05），见图4B、4C。

图4 LUAD 患者LDHA/LDHB 的总体生存期曲线

2.5LDHA/LDHB 相关基因GO 和KEGG 通路分析利用DAVID 生物信息学微阵列分析将与LDHA 最相关的前894 个基因进行富集分析，发现这些基因中富集了糖酵解/糖异生、碳代谢作用和氨基酸的生物合成。为了在LDHA 高表达和生存期较短的患者中识别出调控方向相同的基因，我们将与LDHA 相关性最高的894 个基因与LUAD 中100 个存活相关上调基因进行交集，在交叉点检测到LDHA 和LUAD存活相关的49 个基因。对其GO 功能富集和KEGG途径分析，结果表明，差异表达基因在微管、中间体、染色体分离等过程中显著富集。

同理，使用DAVID 生物信息学微阵列分析将与LDHB 最相关的前283 个基因进行富集分析，发现这些基因中富集了未折叠结合蛋白、伴侣复合物。为了在LDHB 高表达和存活期较低的患者中识别出具有相同调控方向的基因，我们将与LDHB 相关性最高的299 个基因与LUAD 中100 个存活相关上调基因进行交集，在交叉点检测到与LDHB 和LUAD 存活具有相关性的49 个基因。对其进行GO 功能富集和KEGG 途径分析，结果表明，差异表达基因在微管、脱氧核糖核苷酸的代谢过程中显著富集。

2.6LDHA/LDHB 与免疫浸润的相关性分析 我们使用TIMER 数据库分析LDHA/LDHB 的表达与多种浸润性免疫细胞的关系，结果表明，LUAD 中LDHA的表达水平与辅助型T 细胞2（Th2）细胞呈显著正相关（P＜0.05），与B 细胞、CD4+T 细胞、中性粒细胞呈负相关（P＜0.05）。LUAD 中LDHB 的表达水平与Th2呈显著正相关（P＜0.05），与自然杀伤（NK）细胞呈显著负相关（P＜0.05）。见图5。

图5 TIMER 数据库中LDHA/LDHB 与不同免疫细胞的浸润相关性散点图

为了进一步验证基因与免疫浸润的相关性，通过GEPIA 数据库中探究LDHA/LDHB 表达与T 细胞检查点（如CD27、CD134 和CD197）之间的相互关系。结果显示，LDHA/LDHB 表达与LUAD 中CD27、CD134 和CD197 的表达显著相关（P＜0.05）。见图6。

图6 LUAD 中LDHA/LDHB 表达与CD27、CD134 和CD197 之间相关性散点图

3 讨论

本研究主要基于生物信息学的方法研究LDHA/LDHB 表达水平与LUAD 的关系。研究表明，LDHA/LDHB 在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、肾癌等多种人类癌症中普遍存在表达异常的情况[8-11]。LDH 是参与糖酵解的关键酶，通常通过加强有氧糖酵解促进肿瘤进展[12]。在本研究中，我们对不同公共数据库中LDHA/LDHB 表达水平与LUAD 之间的关系进行全面分析，发现LUAD 组织中LDHA/LDHB 的表达显著上调，LDHA/LDHB 表达水平与LUAD 的分期、淋巴结转移状态、免疫细胞浸润和不良预后相关。在细胞免疫方面，LDHA 的失活导致乳酸生成减少和肿瘤pH的中和，然后介导CD8+T 细胞和NK 细胞聚集，抑制肿瘤进展[13]。LDH 相关的乳酸积累甚至可以直接破坏T 细胞和NK 细胞，导致肿瘤免疫逃逸[14]。在本研究中，我们使用TIMER 数据库分析LDHA/LDHB 的表达与多种浸润性免疫细胞的关系，结果表明，LUAD 中LDHA 的表达水平与Th2 细胞呈显著正相关，与B 细胞、CD4+T 细胞、中性粒细胞呈负相关。LUAD 中LDHB 的表达水平与Th2 细胞呈显著正相关，与NK 细胞呈显著负相关。这些结果有力证实了LDHA/LDHB 参与LUAD 免疫应答，是抑制肿瘤免疫逃逸和免疫耐受的潜在靶点。

LDH 表达升高与LUAD 患者的不良预后相关。从代谢的角度来看，无论在常压或缺氧环境中，恶性肿瘤细胞都处于糖酵解的活跃状态，由于Warburg效应，乳酸产生增强。LDH 是糖酵解过程中丙酮酸转化为乳酸的催化剂，癌细胞绕过氧化磷酸化利用LDHA 将丙酮酸还原为乳酸[15]。这将丙酮酸的代谢前体转移到戊糖磷酸途径，为癌细胞生长提供代谢基础。此外，LDH 被认为是组织破坏的指标，在癌症患者中，由于细胞增殖能力强，癌细胞周期缩短，导致坏死风险增加。且邻近的正常组织如肺、肝和骨可能被癌细胞侵袭[16]，这些器官的损伤也会导致LDH水平升高。LDH 受细胞内缺氧诱导因子（HIF）的调控，缺氧或基因突变使HIF 合成增加，进而导致与血管生长、肿瘤转移、糖酵解以及抗凋亡等一系列相关蛋白的过度表达，这有助于增加癌细胞的增殖和侵袭[17]。所有这些机制可能共同促进癌症患者LDH 水平的升高，使其成为判断肿瘤预后的预测因子。

综上所述，本文研究表明LDHA/LDHB 在LUAD发生、进展、预后判断的方面发挥重要作用。通过多种数据库的数据分析证明LDHA 和LDHB 参与了LUAD 的进程，可作为LUAD 相关的一种潜在的预后生物标志物。这些发现可能有助于我们进一步了解LDHA 和LDHB 的作用，以及为LUAD 预后评估及靶向治疗提供价值。