槲皮素对糖尿病大鼠肾脏保护作用研究

黄小翠，于赵龙，祝子健，廖梓妤，程 铭，李加林，吴素珍，3

（1. 赣南医学院基础医学院；2. 赣南医学院药学院；3. 赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 341000）

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一［1-2］。糖尿病患者常伴随严重的肾功能损害，其特征性病理改变是细胞外基质堆积、肾小球硬化及肾小管间质纤维化［3］。糖尿病肾病发病机制尚不完全清楚，它很可能与糖代谢紊乱、血流动力学及血液流变学异常、遗传、氧化应激、炎症等因素有关，高血糖、蛋白尿均能促进其进展［4-5］。DN 的主要病理学表现为肾脏体积增大，肾小球基底膜增厚，系膜细胞增生、肥大及系膜区细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）如纤连蛋白（Fibronectin，FN）堆积，最终发展为肾小球硬化和肾脏纤维化［6］。

槲皮素是一种存在于很多中药中的黄酮醇类化合物，具有广泛的生物活性，近年来研究发现其具有抗氧化、抑制肿瘤、抗炎、降血脂等多种药理作用。文献报道槲皮素有改善DN 作用，能减轻肾小球肥大症状，减少蛋白尿，是有效防治糖尿病肾病的药物之一［7-10］。本研究应用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）给药，复制大鼠糖尿病模型，给予一定剂量的槲皮素治疗后，收集大鼠血液与尿液标本，检测肾脏损伤相关指标，探讨槲皮素对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级SD雄性大鼠，体重（200±20） g，购于赣南医学院实验动物中心，动物许可证号SCXK（赣）2014-0001。槲皮素由本实验室自制，纯度＞95%。三诺安稳型血糖仪（长沙三诺生物传感技术有限公司）；链脲佐菌素（Sigma）；蛋白质分子量Markers（Fermentas MBI）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；ECL发光液（Thermo公司）；β-actin 抗体、Fibronectin 抗体（Santa Cruz 公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔（艾美捷科技有限公司）；其他化学试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 32 只SD 大鼠饲养1周使其熟悉环境，首先称量体重和测空腹血糖，再随机取16只作为对照组，分正常对照组和槲皮素对照组，每组8 只；其余16 只大鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）1 次，按55 mg·kg-1剂量正常给药，48 h 血糖稳定后测随机血糖，若血糖≥16.7mmol·L-1则表明糖尿病模型建立成功。随后再将成功建立模型的糖尿病大鼠，随机分成糖尿病组与槲皮素治疗组各8 只。成模当日给药，槲皮素对照组和槲皮素治疗组槲皮素给药剂量均为100 mg·kg-1，之后每天上午单次定时灌胃，同时正常对照组和糖尿病组灌胃等体积的生理盐水，给药时间为12 周。所有大鼠在实验期间均为标准饮食，自由饮水。

1.2.2 血液、尿液收集及相关指标检测 给药12周结束后，使用代谢笼收集24 h 尿样，记录尿量，检测24 h 尿总蛋白、尿肌酐与尿糖；取大鼠血样，检测各组大鼠血液中血糖、血尿素氮及血肌酐含量。

1.2.3 动物标本收集与制作 动物处死后，迅速取出其肾脏，称重，置于装有预冷PBS 的器皿内，修剪掉肾脏周围的脂肪组织和包膜。沿着肾脏纵向切开，去除髓质，迅速将肾皮质剪碎，取部分肾皮质用甲醛固定，用于形态学实验。另取部分肾皮质放入1.5 mL 的EP 管中，加入适量细胞裂解液，用静音高速匀浆仪匀浆至看不到任何组织团块，EP管在冰上静置裂解10 min 后，以12 000 rpm 的转速，在4 ℃条件下，离心15 min，取上清，用BCA 法测定各组蛋白浓度，按30 µg·（10 µL）-1将各组蛋白配平后加入上样缓冲溶液，用于后续的Western Blot实验。

1.3 大鼠肾皮质形态学观察

1.3.1 HE 染色 肾皮质切片依次用二甲苯和不同浓度的酒精脱蜡，用苏木素对细胞核进行染色，用伊红染液染色染细胞质，最后脱水用中性树胶封片，拍照。

1.3.2 马森染色 采用马森染色（Masson Stain）表征纤维化。染色流程如下：石蜡包埋肾皮质切片后，常规脱水；采用重铬酸钾处理肾脏组织，Weiger氏铁苏木素染色，丽春红酸性品红液染色，苯胺蓝液复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，拍照。

1.4 FN 表达检测 Western Blot 和免疫组化方法检测SD大鼠肾皮质胞外基质FN表达。

1.4.1 Western Blot方法检测FN的表达 Western Blot实验检测肾皮质中蛋白表达水平，再将蛋白质从胶转移到PVDF 膜（Merck Millipore， R1NB76879）上以后，用5%脱脂奶粉封闭，然后与抗FN（1∶10 000，Merck Millipore，#AB1954）及β-actin（1∶1 000， Cell Signalling Technology， 3700S）的抗体4 ℃孵育过夜。随后，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗常温孵育2 h。最后使用化学发光成像系统（Bio-Rad Chemi-Doc MP）对条带进行显影，Image J读取条带灰度值。

1.4.2 免疫组化方法检测FN 的表达 免疫组化采用SP 试剂盒，包括：过氧化物酶阻断液（试剂A）、非免疫性动物血清（试剂B）、生物素标记的二抗（试剂C）、链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D）；DAB 试剂盒，包括：DAB 缓冲液20×（试剂A）、DAB 底物20×（试剂B）、DAB 色原20×（试剂C）。免疫组化具体操作步骤按试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0software进行数据分析和作图。各组数据用平均值±标准差表示，组间比较用单因素方差（One-way ANOVA）进行统计学分析，组内各指标的多重比较用SNK 检验，P＜0.05为差异有统计学意义，所有实验均为重复3次以上的独立实验。

2 结果

2.1 槲皮素对糖尿病肾病大鼠肾脏损伤相关指标的影响 糖尿病组血糖≥16.7 mmol·L-1提示糖尿病肾病模型建立成功。与正常对照组比较，糖尿病组肾重/体重、血糖、尿糖、血肌酐、血尿素氮、尿量、尿总蛋白增加，尿肌酐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；槲皮素对照组与正常对照组比较各指标差异均无统计学意义（P＞0.05）；与糖尿病组比较，槲皮素治疗组肾重/体重、血糖、血肌酐、血尿素氮、尿量、尿总蛋白降低，尿肌酐增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠临床参数分析/ˉx±s

2.2 槲皮素对STZ 诱导的糖尿病大鼠肾脏形态学的影响 HE 染色结果显示，与正常对照组相比，槲皮素对照组肾小球无明显变化，但糖尿病组肾小球基底膜出现弥漫性加厚，而槲皮素治疗后肾小球基底膜弥漫性增厚出现明显改善（图1A）。

马森染色结果显示，与正常对照组比较，槲皮素对照组肾脏中胶原的堆积无明显差异，糖尿病组大鼠肾脏胶原的堆积明显增多，而槲皮素治疗组胶原的堆积与糖尿病组比有明显改善（图1B）。

2.3 槲皮素对STZ 诱导的糖尿病大鼠肾皮质FN表达的影响 与正常对照组比较，糖尿病组FN蛋白表达量显著增加（P＜0.01）；与糖尿病组比较，槲皮素治疗组FN表达量显著减少（P＜0.01）（图2）。

图2 槲皮素对STZ诱导的糖尿病大鼠肾皮质中FN表达的影响

3 讨论

在持续高糖状态下，体内氧化应激和非酶糖基化反应均很明显，在糖尿病肾病发病中起重要作用，抑制氧化糖基化可能延缓或减轻糖尿病肾病并发症［11］。因此，有效控制血糖也是治疗糖尿病肾病的一种最常见的手段。氨基酸脱氨基产生的NH3和CO2在肝脏中合成尿素。肾脏为排泄尿素的主要器官，若肾脏发生病变，肾小球对血尿素氮的清除率下降，造成血尿素氮水平升高［12］。本研究结果显示，糖尿病大鼠血尿素氮比正常对照组明显升高，给予槲皮素治疗后血尿素氮与糖尿病组比明显降低，这可能是因为糖尿病组大鼠肾实质受损，滤过能力下降所致，而给予槲皮素治疗后，肾脏损伤有所恢复，从而降低血尿素氮水平。

本研究结果显示，给予槲皮素治疗的糖尿病大鼠其血清肌酐水平与糖尿病组比明显下降，尿肌酐水平与糖尿病组比升高。肌酐大部分是从肾小球滤过，不被肾小管重吸收，肾小球滤过功能损伤时，影响肌酐的排出，导致血中肌酐升高，尿中肌酐减少，因此，血肌酐与尿肌酐水平可粗略反映肾小球滤过功能，反映肾实质的损伤情况［13-16］。本研究结果表明，槲皮素可使糖尿病大鼠肾小球滤过功能有所恢复。

胞外基质堆积是糖尿病肾病病理特征之一［17］，胶原蛋白和纤连蛋白均属于胞外基质蛋白。本研究结果显示，与正常对照组比较，糖尿病大鼠肾脏肾皮质纤连蛋白表达和胶原蛋白堆积明显升高，而给予槲皮素治疗的糖尿病大鼠其肾皮质纤连蛋白（FN）表达和胶原蛋白堆积比糖尿病组均明显下降，这说明槲皮素治疗的糖尿病大鼠其肾脏胞外基质堆积有所改善，槲皮素对糖尿病肾病大鼠肾脏有一定的保护作用。

研究发现，TGF-β/Smads 信号通路在糖尿病肾病动物模型和细胞模型中均被激活，导致系膜细胞产生过多的胞外基质成分，且进行性积聚，逐步发展为肾小球硬化［18］。有文献报道，TGF-β/Smads 信号通路的激活在诱导肾小球和肾小管的细胞肥大、介导足细胞损伤、促进系膜细胞增生、基底膜增厚以及肾间质纤维化中起重要作用，是糖尿病肾病发病机制的共同通路。通过对TGF-β/Smads信号通路的抑制可减轻糖尿病肾病的进程［5，19-21］。本研究发现，槲皮素能抑制糖尿病肾病小鼠肾脏中胞外基质蛋白堆积，肾小球基底膜增厚、血肌酐和血尿素氮均有所改善，从而使肾脏损伤有所恢复，但其分子机制是否与槲皮素对TGF-β/Smads信号通路的抑制有关还值得进一步探讨。