microRNA在脓毒症诊断中的研究进展

汪凌燕，张 珂，仇鹏业，饶兴愉

（1. 赣南医学院第一临床医学院；2. 赣南医学院第一附属医院儿童医学中心，江西 赣州 341000）

脓毒症的定义标准最早在1991 年的共识会议上提出，该定义基于全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome， SIRS）的概念，根据疾病的严重程度将脓毒症分为脓毒症、严重脓毒症、脓毒症休克。2001 年欧洲和美国协会共同参与，对此项共识定义进行了修订，为8种不同的器官系统定义了功能障碍极限值［1］。此后，欧美危重病医学会的一个联合工作组重新审查了脓毒症及脓毒症休克的长期定义，并于2016年提出了脓毒症及脓毒症休克的第三个国际共识定义（sepsis 3.0）［2］。脓毒症3.0将脓毒症定义为严重感染因素引起的机体过度反应，导致器官功能障碍或循环衰竭。在充足的液体复苏基础上仍伴有无法纠正的持续性低血压即为脓毒症休克，其潜在的循环、细胞和代谢异常比脓毒症有更高的死亡风险［2］。脓毒症的发病机制包括炎症反应失衡、免疫功能障碍、线粒体损伤、凝血功能障碍、神经内分泌免疫网络异常、内质网应激、自噬等病理生理过程，并最终导致多器官功能障碍［3］。鉴于脓毒症临床特征的复杂性，其早期诊断仍存在极大的挑战性。目前170多个生物标志物已确定被用于评估脓毒症，包括C反应蛋白、降钙素原、各种细胞因子及细胞表面标记物等［3］。由于这一系列的标志物在特异性和敏感性方面都存在一定的局限性，因此，寻找新的潜在生物标志物和治疗靶点就变得极为迫切。miRNA 在炎症反应中起重要作用，最近的研究表明，微RNA（MicroRNA，miRNA）可作为早期诊断脓毒症的一类具有潜在价值的新型生物标志物。现就miRNA 在脓毒症及其并发症的早期诊断及治疗过程中的作用进行综述，探讨这一新型生物标志物的应用价值。

1 miRNA

1.1 miRNA 的结构及参与细胞调控的机制microRNA 是真核生物中一个巨大的基因表达调控家族，其长度约为21 个核苷酸［4］，第一个miRNA（lin-4）来自秀丽隐杆线虫，由WIGHTMAN B 等［5］在1993 年发现，它是控制发育时间的内源性基因调节器。miRNA 的生物发生始于人类RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ的转录，miRNA 的转录通常由RNA 聚合酶Ⅱ完成，是由独立基因的RNA 聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）特异转录本或蛋白质编码基因的内含子加工而成的［6］。在经典途径中，初级前体（pri-miRNA）加工分为两个步骤，由两个核糖核酸酶Ⅲ(Ribonuclease Ⅲ，RNaseⅢ)家族的酶催化，分别是Drosha（首先在果蝇中发现）和Dicer，在dsRNA结合蛋白复合物（dsRBPs）中起作用。在细胞核中pri-miRNA被切割成大约70个核苷酸的茎环结构，称为pre-miRNA。这个过程是由一个微处理器复合体完成的，该复合体由Drosha 和d DiGeorge 综合征关键区域基因8（DGCR8）组成。Drosha 是RNase Ⅲ酶的成员，它是一种双链RNA 特异性内切核糖核酸酶。DGCR8 是一种双链RNA 结合蛋白，作为微处理器复合体的非催化亚基发挥作用［7］。哺乳动物中DGCR8 和RNA 结合蛋白这一经典案例很好地阐释了miRNA 生物调控的经典途径。我们以此为例，第一步发生在细胞核中，Drosha-DGCR8 复合体将pri-miRNA 加工成约70 个核苷酸的前体发夹（pre-miRNA），该前体通过Exportin-5/RanGTP复合体输出到细胞质中，某些pre-miRNA 是由非常短的内含子剪接和脱支的结果，可省略Drosha-DGCR8 步 骤［4］。胞 质 前miRNA 随 后 作 为RNA 诱导沉默复合物（RISC）负载复合物的一部分被RNase Dicer 结合，包括TRBP 和Ago2［8］。在哺乳动物中，Ago2 可通过切割一些pre-miRNA 的3'臂支持Dicer 加工，从而形成一个额外的加工中间体，称为Ago2 切割前体miRNA（ac-pre-miRNA）。随后，Dicer通过TRBP的协助，在细胞质中分裂产生1～20 bp的miRNA/miRNA 双 链［4］。 经 处 理 后，miRNA/miRNA 双链中的一条被优先合并到miRNA 诱导的沉默复合物（miRISC）中，而另一条链则被释放并降解。通常，保留链是在miRNA/miRNA 双链中具有不稳定的碱基对5'端，miRNA 链并不总是miRNA 的副产物，也可以加载到miRISC 中作为miRNA 发挥作用［4，9］。miRNA 几乎参与了所有被研究细胞的调控过程，因此，其表达与人类的许多疾病息息相关，这就为miRNA 作为诊断脓毒症的生物标志物提供了潜在的价值。

1.2 miRNA 的功能 miRNA 可将一个RNP 复合体招募到互补RNA 中，即提供一个序列特异性的结合成分，使RNP 作用于特定的靶标，从而指导靶基因的激活或抑制，并对蛋白质输出进行微调，是生物生长和细胞内稳态的关键调控因子。miRNA 通过互补碱基配对，以完全或不完全的方式靶向mRNA，有证据表明，miRNA 可以靶向30-UTR 以外的mRNA，而成熟的miRNA 可以通过结合50-UTR来改变基因的表达［10］。参考资料库(http://www.mirbase.org/）miRBase 目前拥有大约1 917 个人类前体和2 656 个成熟miRNA，结合计算机高通量方法和实验技术，研究表明，确实存在2 300 个人类成熟的miRNA，其中1 115 个目前在miRBase 中注释［11］。据推测，单个miRNA 可以靶向数百个mRNA，相反，单个mRNA 被多个miRNA 靶向。单个miRNA 种类也可能抑制数百种蛋白质的产生［12］。众所周知，蛋白质是一切生命的物质基础，是机体细胞的重要组成部分，可以维持机体正常新陈代谢和各类物质在体内输送，也可作为抗体参与机体的体液免疫。BAYRAKTAR R 等[13]提出，miRNA 可能有助于细胞间的通讯，间隙连接（Gap junction，GJ）是所有实体组织质膜中的细胞间通道，用于相邻细胞之间的直接通信，它们允许小分子的被动转移。研究发现，成熟的miRNA 双链体可以直接通过GJ 通道转移，并靶向邻近细胞中的mRNA［7］。miRNA 可用作治疗剂（miRNA 模拟物）或作为治疗剂的靶点（抗miRs），使用基于miRNA 的疗法治疗疾病。目前，处于临床开发阶段的癌症治疗方法就是通过miRNA 模拟物补充肿瘤抑制性miRNA 或使用抗miRs 抑制oncomiRs。除癌症外，miRNA 在其他疾病治疗中的应用价值也在不断的研究开发中。miRNA 是一个庞大的家族，其生物功能也具有多样性，在生长发育、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡及细胞代谢等生物过程中皆占重要地位。

1.3 miRNA的特性 研究者们已从血液、唾液、尿液、粪便、脑脊液、滑膜液、胰液、胆汁、胃液及其他体液中分离出了各种miRNA，并正在检测其作为相关疾病生物标志物的实用性［12］。某些体液中细胞外miRNA 的水平和组成与各种病理密切相关，包括癌症、糖尿病和组织损伤等。这些结果证实，体液中细胞外miRNA 的表达水平是确定和监测个体生理状态的一种有潜在价值的方法［13］。一系列的研究证据表明［14］，可以通过无创或微创的方法获取miRNA，使之成为容易获取的生物标本，从而为疾病的诊治新手段研发提供了可能。

miRNA 在外泌体和细胞外囊泡中由细胞分泌而成，分泌的miRNA 在体液中保持相应的稳定状态。LIANG H W等［15］建立了几个关于胞外miRNA稳定性的生物模型，并结合细胞外miRNA 在体液中以高浓度和足够完整的方式循环，证实细胞外miRNA可能以某种方式进入细胞以防止其降解。miRNA由供体细胞通过小膜泡分泌，保护供体细胞免受胞外RNase 活 性 的 影 响［16］，从 而 保 持miRNA 的 稳定性。

鉴于miRNA 的碱基配对原则等结构与机制的特殊性，miRNA 在时间与空间上都具有特异性，同时，多个转录因子的协同作用增加了其特异性。已有大量研究证据表明，miRNA 可在不同生理机理中特异性表达。如：DIECKMANN K P 等［17］证实，miR-371a-3p 的血清水平可作为生殖细胞肿瘤的敏感性和特异性新生物标记。SCHULTZ N A 等［18］推断miR-26b、miR-34a、miR-122、miR-126、miR-145、miR-150、miR-223、miR-505、miR-636、miR-885 可作为区分胰腺癌患者与健康人的特异性生物标志物。TOMIMARU Y 等［19］通过qRT-PCR 技术及病例对照研究方法证实，血浆miR-21可作为肝细胞癌潜在的特异性生物标志物。

2 miRNA在脓毒症中的调控机制

2.1 miRNA通过TNF途径参与炎症反应 miRNA在不同疾病先天性和适应性免疫的调控机制中发挥重要作用这一观点已被广泛接受。miRNA 可调节辅助T 细胞和控制T 细胞的生长，这在控制宿主对疾病的反应过程中至关重要。在脓毒症的发生发展过程中，宿主免疫系统会发生促炎和免疫抑制。脓毒症在炎症状态下会产生多种细胞因子，如IL-10、IL-6 等，其中最具代表性和最常见的有肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。miRNA 可直接靶向TNF 途径介导炎症反应［20］，PUIMÈGE L等［21］证明，miR-511实际上是一种TNF受体1蛋白，能影响TNF敏感性，部分预防了TNF依赖性内毒素休克综合征。此外，TNF-α的产生在转录和翻译水平上受miRNA控制，DAN C等［22］研究表明，上调miR-181 可促进TNF-α mRNA 降解。HUANG H C等［23］报道，在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后，新生儿单核细胞中miR-125b 水平与TNF-α表达相关，TNF-α表达升高时，miR-125b显著降低。除了TNF-α，其他促炎细胞因子如IL-6 在脓毒症患者中的表达也显著升高，ZHOU J H 等［24］报道miR-146a下调与脓毒症患者IL-6水平升高相关。

2.2 miRNA 通过Toll样受体调控炎症反应 在脓毒症早期，病原微生物与免疫细胞表面的Toll 样受体结合，激活细胞内信号传导通路，使促炎因子和抗炎因子转录增加。miRNA可通过靶向Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）信号通路调控炎症，TLR介导的信号通路主要激活核因子-κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB），NF-κB 是免疫调节和促炎介质表达的重要转录因子。研究表明，miR-146a、miR-125和miR-155等在TLR/NF-κB 介导的先天免疫和炎症反应的负调控中发挥重要作用［25］。MONK C E 等［26］通过研究发现，初级miR155 和其他几种miRNA 的转录依赖于NF-κB。TAGANOV K D 等报道，使用LPS 刺激人单核细胞THP-1 可以迅速诱导miR-146a和miR-146b 的表达［27］。miR-146a 可以直接作用于IRAK-1和TRAF6，它们是TLR信号通路中的关键适配器分子［28］。由此证明，TLR 介导的信号通路在脓毒症中至关重要。随着脓毒症的发展，免疫系统会被部分介导的miRNA 重新编程进入免疫抑制状态，宿主免疫抑制被认为是导致脓毒症后期死亡的原因之一。miR-21 和miR-181b 在脓毒症小鼠骨髓源性抑制细胞中表达上调，通过影响转录因子Stat3和C/EBPβ阻止巨噬细胞和树突状细胞分化［29-30］。此外，骨髓细胞的miR-155与LPS刺激的BMAL1水平呈负相关［31］。也有研究证实，多种miRNA 如mi-R210、miR-23b 和miR-29a 可通过影响不同的免疫细胞抑制脓毒症时NF-κB和IL-6的表达［32］。这些研究强调了miRNA在脓毒症病理生理学中的调控作用。

3 参与脓毒症的相关miRNA

微生物培养是区分脓毒症与其他疾病的金标准，但这种方法耗时长，且伴有假阴性的情况，严重耽误病情的诊断及治疗。目前用于诊断脓毒症的生物标志物有PCT、CRP、IL-6 等，但这些标志物的特异性较低，与其他炎症性疾病难以鉴别，在确诊中存在一定缺陷。已有研究显示，miR-16、miR122和miR133a在脓毒症患者血清中表达升高，而miR-25、miR-181b 等 部 分miRNA 表 达 降 低。miR133a 可 以通过靶向SRIT1 加剧脓毒症的炎症反应，上调miR-25 水平可减轻脓毒症相关肾损伤。有研究报道，miRNA-25 诊断脓毒症的临床准确性优于CRP 和PCT，miRNA-25 水平下降与脓毒症严重程度、SOFA评分、CRP、PCT水平相关［33］，miRNA-150可作为判断脓毒症预后的指标［34］。FATMI A 等［35］推断，miR-23b可以作为新生儿败血症早期诊断生物标志物。

3.1 脓毒症所致肝功能损伤相关miRNA 肝功能损伤是脓毒症常见的并发症，国内外有很多文献报道miRNA 在其中的价值。研究证明，miR-373-3p 可以促进THLE-3 细胞活力并抑制细胞凋亡，下调miR-373-3p 可以减轻脓毒症引起的肝功能损伤［36］。miR-155 被确认在脓毒症所致感染性肝损伤中起重要作用，miR-155 拮抗剂通过靶向Nrf-2 抑制氧化应激介导的内质网应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡，减轻脓毒性肝损伤，提示miR-155是脓毒性肝损伤的治疗靶点［37］。miR-30E 可通过JAK/STAT 信号传导通路促进脓毒症中肝细胞增殖并抑制肝细胞凋亡［38］，同样可将miR-30E 作为治疗靶点，上调miR-30E 水平可缓解脓毒症肝损伤。miR-122 是一种新发现的、独立的、具有潜在价值的预测脓毒症肝损伤的生物标志物［39］。以上研究说明，miR-373-3p、miR-155、miR-30E、miR-122 都可作为脓毒症肝损伤诊断的生物标志物，并可作为治疗靶点减轻疾病症状。

3.2 脓毒症所致肾功能损伤相关miRNA 肾功能损伤在脓毒症发展过程中并不少见。有学者证实，miR-452 在脓毒症性肾损伤的肾小管细胞中被诱导表达，其诱导作用由NF-κB 介导，败血症小鼠的血清和尿液miR-452在肾功能不全或组织损伤早期增加。脓毒症伴急性肾损伤(Acute kidney injury, AKI）患者血清和尿miR-452 水平明显高于无AKI 患者，Spearman 试验显示，脓毒症患者尿miR-452 与血清肌酐显著正相关［40］。因此，miR-452 尤其是尿中miR-452 的增加可能是脓毒症患者早期发现AKI 的有效生物标志物。miR-21-5p 可改善肾功能和肾组织病理损伤，减轻血清炎症反应，下调miR-21-5p 水平可部分逆转脓毒症急性肾损伤［41］。miR-21 是从局部缺血的四肢通过血清外泌体运至远处脏器的。在肾脏中，增强的外泌体miR-21将集成到肾小管上皮细胞，然后靶向下游PDCD4/NF-κB 和PTEN/AKT途径，发挥抗炎和抗凋亡作用。研究表明，miR-21对脓毒症患者肾脏有保护作用［42］。

3.3 脓毒症所致肺功能损伤相关miRNA 肺功能损伤在脓毒症所致器官功能障碍中较为常见，脓毒症发展至严重阶段可导致急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS），严重危害患者生命，早期识别对脓毒症的诊疗至关重要。有研究报道，急性肺损伤小鼠的血清外泌体将miR-155传递至巨噬细胞，刺激NF-κB活化，并诱导TNF-α和IL-6 的产生，此外，血清外泌体来源的miR-155 通过分别靶向SHIP1和SOCS1促进巨噬细胞增殖和炎症发生［43］，miR-155 是脓毒症急性肺损伤的关键介质，可作为脓毒症早期诊断的潜在生物标志物。miR-23a可抑制脓毒症中的细胞凋亡，改善脓毒症肺损伤［44］。其中涉及到的大多数研究样本量较少，仍需大量的研究证实miRNA 在此类疾病中的具体作用机制，这些研究可能为脓毒症的早期诊断及治疗提供新的方法及新思路。

3.4 脓毒症所致心功能损伤相关miRNA 脓毒症导致心功能损伤的具体机制尚不明确，脓毒症的炎症反应可加剧心功能损伤的进展。有学者推断，miR-21 可影响心肌细胞的活力，且使炎症细胞因子增加［45］，血清miR-21 水平在脓毒症急性心功能损伤中增加，在疾病的早期诊断中具有重要价值，miR-21可靶向调节心肌细胞活力和炎症反应。miRNA-146被认为在先天免疫和由LPS诱导的炎性应答有效负调节中占重要位置。在LPS诱导的脓毒症中，过度表达miR-146a能靶向ErbB4负性调节NF-κB的激活和炎性细胞因子的产生，从而减轻心肌损伤［46］。此外，miR-214、miR-497、miR-101、miR-29a、miR-26a-5p 等在脓毒症所致心功能损伤中也有重要作用。

3.5 脓毒症所致凝血功能障碍相关miRNA 促凝和抗凝功能紊乱是脓毒症发生发展的重要机制之一。有报道推断，miR-19a-3p 可下调组织因子并作为脓毒症诱导的弥散性血管内凝血的潜在治疗靶点发挥作用［47］。血清miR-122水平与血清活化部分凝血酶时间的比率和纤维蛋白原及抗凝血酶水平相关，可能对脓毒症凝血功能障碍患者的预后有重要影响。miR-130a、miR-16、miR-15a 等在凝血系统中起重要作用，但在脓毒症所致凝血功能障碍中的具体机制不甚明确，仍需进一步研究加以证实。

4 小结与展望

综上所述，越来越多的证据证明miRNA 参与了脓毒症病理生理过程的调控。尽管miRNA 在临床应用中还存在许多问题和挑战，但它们有潜力成为脓毒症早期诊断的新生物标志物和治疗靶点。在现有的研究基础上需进一步深入研究探讨以提高其临床应用价值，同时，有必要进一步探索组织或器官特异性的miRNA，这可能对脓毒症的靶向治疗更有意义。此外，未来的研究还应侧重于阐明其分子机制，以进一步了解疾病过程。miRNA 可能为脓毒症的研究提供新视角，miRNA 相关药物的开发可能具有广阔前景。