全氟化碳纳米乳在肿瘤诊疗中的研究进展*

刘 灿，陈沁颖，吴彦萍，涂家生，孙春萌

国家药品监督管理局 药物制剂及辅料研究与评价重点实验室，中国药科大学药用辅料及仿创药物研发评价中心,中国药科大学 药学院，南京210009

全氟化碳（perfluorocarbon，PFC）是分子结构中与碳原子连接的氢原子全部被氟原子所取代的一类有机化合物，常温下为无色、无味、无毒的透明气体或液体。医学研究中常用的PFC 化合物碳原子数一般为5～12 个，其沸点随着分子量的增加而升高[1]。1966 年，Clark LC等[2]首次报道了PFC 可以作为液体通气的介质，具有良好的氧溶性。除此之外，PFC还具有优异的生物安全性和生物相容性、疏水性和疏脂性，在进入体内后不参与新陈代谢，不会对体内的组织和器官产生毒性，因此广泛应用于医学研究中[1]。然而PFC 与水不互溶，表面张力很小，直接静脉注射极易栓塞，故常制成与人体血液pH、电解质浓度和渗透压相似的纳米乳[3]。

由于PFC 纳米乳具有高携氧性、循环时间长、性质稳定等优点，广泛应用于肿瘤的诊断和治疗中[3]。一方面，基于PFC 的高携氧性，PFC 纳米乳能向肿瘤环境递送氧气，缓解肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的缺氧状态，提高氧依赖性治疗方式的疗效[4]；另一方面，基于PFC 的相变性，PFC 纳米乳可以构建相变纳米液滴，在高能量的激发下发生气态到液态的转变，广泛应用于超声造影[5]和药物递送系统[6]。同时，PFC 纳米乳的种类也影响着其性质和应用。本文系统地介绍了PFC 纳米乳的种类及其在肿瘤诊疗中的应用，并提出了目前存在的问题及未来的研究方向。

1 PFC 纳米乳的种类

PFC 纳米乳由外壳和PFC 核心两部分组成。常用的PFC 核心包括全氟丙烷（octafluoropropane，OFP）[7]、全氟丁烷（decafluorobutane，DFB）[7]、全氟戊烷（perfluoropentane，PFP）[8]、全氟己烷（perfluorohexane，PFH）[9]、全氟辛基溴（perfluorooctyl bromide，PFOB）[10]、全氟三丁胺（perfluorotributylamine，PFTBA）[11]等。目前，外壳材料的发展极大地丰富了PFC 纳米乳在肿瘤诊疗领域的设计、合成和功能化策略[12]。根据外壳的组成，PFC 纳米乳主要分为白蛋白PFC 纳米乳、脂质PFC 纳米乳、聚合物PFC 纳米乳和其它PFC纳米乳（表1）。

表1 PFC 纳米乳常用的外壳组成及核心种类

1.1 白蛋白PFC 纳米乳

临床已证明白蛋白是一种安全的生物材料，广泛应用于设计药物递送系统。作为药物载体，白蛋白能够避免药物被血液清除，可减少抗肿瘤药物所产生的不良反应。由于能够稳定PFC，白蛋白是最早应用于制备PFC 纳米乳的外壳材料之一[25]。白蛋白PFC 纳米乳多以超声乳化法制备，工艺简单。目前，最广泛应用于PFC 纳米乳外壳材料的白蛋白包括牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）[13]、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）[11]以及变性BSA[9]。白蛋白外壳可以通过疏水相互作用负载药物进行修饰。Ren H等[11]用超声乳化法制备了人血清白蛋白全氟三丁胺纳米乳，并在白蛋白表面负载光敏剂IR780（IR780@PFTBA@HSA），用于光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）。白蛋白外壳的表面也可以功能化修饰，用于增加体内长循环等。Ren H等[26]制备了红细胞膜修饰的人血清白蛋白全氟三丁胺纳米乳，该功能化的纳米乳能够实现免疫逃逸，减少非特异性细胞摄取，从而延长在体内的循环时间。

1.2 脂质PFC 纳米乳

脂质PFC 纳米乳通常由脂质作为外壳，负载PFC 或其他药物作为核心。常用的脂质材料主要包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆 碱（1，2 -dipalmitoyl -sn -glycero -3 -phosphocholine，DPPC）、二油酰基卵磷脂（1，2-dioleoyl-snglycero-3-phosphocholine，DOPC）等[25]。与白蛋白外壳相比，脂质壳可以通过调节各组分的组成比例来调节壳的性质。Chattaraj R 等[14]使用不同比例的DPPC、DOPC 和胆固醇来制备PFC 纳米乳用于超声造影，研究发现，当使用40% DOPC、40% DPPC 和20%胆固醇混合物制备外壳时，其超声对比度比单一DPPC 配方外壳的纳米乳高十倍。脂质PFC 纳米乳也可以在外壳表面进行结构修饰。Yarmoska SK等[27]研究发现增加聚乙二醇化脂质的摩尔百分比可降低PFC 纳米乳的平均尺寸，提高血液循环半衰期，并提高乳腺癌小鼠模型中的超声成像对比度。

1.3 聚合物PFC 纳米乳

聚合物PFC 纳米乳由外层聚合物材料和内部PFC 核心构成。与白蛋白PFC 纳米乳和脂质PFC 纳米乳相比，聚合物PFC 纳米乳可将疏水性药物通过物理包载或共价连接的方式共载于聚合物中，因此具有更高的载药量[12]。目前应用于PFC 纳米乳外壳的聚合物材料主要包括聚乳酸-羟基乙酸（polylactic acid-glycolic acid，PLGA）[16]、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）[17]、聚乳酸（polylactic acid，PLA）[18]、聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）[19]等。与脂质PFC纳米乳相比，聚合物PFC 纳米乳具有更高的稳定性和汽化阈值。Melich R等[16]使用不同材料作为外壳制备了PFC 纳米乳，结果表明，与脂质（DPPC 及DSPE-PEG2000）PFC 纳米乳相比，聚合物（PLGA）PFC纳米乳表现出更好的稳定性，在4℃下储存1 个月后尺寸和多分散性指数均无明显变化。Cao Y等[28]研究发现，与脂质（DPPC、DPPG、DPPE 等）PFC 纳米乳相比，聚合物（PLGA）PFC 纳米乳由于聚合物壳的刚度，需要更高的超声能量才能转化成微泡。除此之外，由于聚合物结构具有多样性，聚合物PFC 纳米乳往往还具有其他特定的功能，如pH 敏感性。Zhang L等[29]以具有pH 敏感性的聚氨基酸聚合物为外壳，以PFP、五氟丁烷为核心，制备了包载多柔比星的纳米乳。该纳米乳在正常生理环境（pH 7.4）中可以维持小粒径180 nm，到达肿瘤微酸性环境（pH 6.8）后，粒径增加至437 nm。PFC 纳米乳尺寸的增加导致其内部拉普拉斯压力降低，降低了PFC汽化阈值，并且通过超声或近红外光的照射，PFC发生相变，从而实现超声诊断。

1.4 其他PFC 纳米乳

生物大分子如壳聚糖[20]、透明质酸[21]、聚多巴胺（polydopamine，PDA）[22，23]等和生物膜[24]也可以作为PFC 纳米乳的外壳材料。基于PDA 良好的生物相容性、生物降解能力和光热转化能力，Zhu JJ等[23]分别以聚乙二醇化的PDA 和PFP 为外壳和核心制备纳米乳（PFC-PDA-PEG）。在近红外光照射下，PFCPDA-PEG 能有效地进行光热转化杀死肿瘤细胞，同时，PFP 核心从液态转变为气态，用于超声成像。有研究直接使用生物膜作为PFC 纳米乳外壳，Zhuang J等[24]制备了以红细胞膜为外壳的PFC 纳米乳，该纳米乳的粒径能够在96 h 内基本保持无变化，具有良好的稳定性。

2 PFC 纳米乳在肿瘤诊疗中的应用

近年来，基于PFC 纳米乳的特殊性质，PFC 纳米乳在肿瘤诊疗方面应用的研究越来越多。其应用主要包括两个方面：①构建携氧载体，向肿瘤环境递送氧气，缓解肿瘤环境缺氧，提高氧依赖性治疗方式的疗效；②构建相变纳米液滴，在高能量的激发下发生气态到液态的转变，应用于肿瘤成像和药物递送系统的研究。

2.1 构建携氧载体

缺氧是TME 的主要特征之一，肿瘤生长迅速使得肿瘤组织内血液需求量急剧增加，引起肿瘤内部血管紊乱及血供不足，无法为肿瘤细胞提供足够的氧。在缺氧环境中，还会产生不良的肿瘤代谢物过氧化氢，该代谢物会促进癌细胞的诱变和转移[30]。目前，氧依赖性治疗方式（如放射疗法、光动力疗法、声动力疗法等）广泛应用于抗肿瘤临床研究中，但其抗肿瘤效果明显受限于实体瘤缺氧微环境。因此，克服TME 缺氧对于改善氧依赖性治疗方式的疗效具有重大的意义。

由于PFC 具有高电负性，分子间作用力弱，具有较高的溶氧能力，其氧气溶解度是水溶液的20倍，并且由于其具有生物化学惰性以及良好的生物相容性，已被批准作为人工血液替代品用于氧气递送[24]。此外，液体PFC 已被证实可以延长单线态氧（1O2）寿命，进一步增强氧依赖性治疗方式疗效[4]。因此，PFC 纳米乳广泛应用于改善肿瘤缺氧环境，增强氧依赖性治疗方式的疗效。

2.1.1 改善放射疗法疗效 放射治疗是临床肿瘤治疗中常用的一种治疗方式。TME 内普遍乏氧，而氧分子在电离辐射杀伤肿瘤细胞的过程中发挥重要作用，这严重制约了临床中放射治疗对肿瘤的杀伤效果[31]。为了提高治疗效果，Zhou ZG等[32]制备了人血清白蛋白全氟三丁胺纳米乳（PFTBA@HSA），通过PFTBA@HSA 释放物理结合的O2来缓解肿瘤缺氧。使用缺氧探针哌莫硝唑对肿瘤切片染色发现，给药5 h 后，PFTBA@HSA 组哌莫硝唑荧光面积仅约为对照组的1/3，表明PFTBA@HSA 可有效缓解肿瘤组织的缺氧状态。药效学实验结果显示，进行放射治疗后肿瘤生长几乎完全受到抑制。Gao M等[33]以全氟-15-冠-5-醚作为核心，以PLGA 作为外壳制备纳米乳，并在外面修饰红细胞膜（PFC@PLGA-RBCM）来延长纳米乳血液循环时间。研究发现，静脉注射PFC@PLGA-RBCM 24 h 后，肿瘤区域的总氧合水平从1.6%显著增加到24%，PFC@PLGA-RBCM 的治疗能够显著增强放射治疗的肿瘤抑制功效，并且未产生副作用。

2.1.2 改善光动力疗法疗效 PDT 是一种新兴的肿瘤治疗方法，通过光敏剂与肿瘤细胞周围氧分子发生反应生成活性氧和自由基，从而发挥抗肿瘤效应。然而肿瘤乏氧环境以及治疗过程中氧含量的进一步消耗限制了PDT 的抗肿瘤效应[34]。为解决这一问题，Hu DR等[21]在透明质酸骨架上通过二硫键连接光敏剂二氢卟酚e6（Ce6），并将携氧的PFH 包封于该接合物中（PFH@HSC），用于向肿瘤环境递送氧气。肿瘤区域的氧合血红蛋白信号强度的半定量分析显示，PFH@HSC 组的氧合血红蛋白信号强度比游离Ce6 组高3.6 倍，显著缓解了肿瘤缺氧。药效学实验发现，PFH@HSC 和光照联合治疗组肿瘤生长抑制能力最强，表明具有携氧功能的PFH@HSC 显著增强了PDT 的治疗效果。Zhang L等[35]分别以携氧的PFOB 和脂质为核心和外壳，制备了包载光敏剂IR780 的脂质PFOB 纳米乳（PFOB@LIPIR780）。研究发现，PFOB@LIP-IR780 明显缓解了肿瘤的缺氧状态，该组的HIF-1α 表达量显著低于LIP-IR780 组。注射PFOB@LIP-IR780 后，小鼠肿瘤区域内氧合血红蛋白信号强度随时间延长逐渐增加，并在注射后24 h 达到最大值。与LIP-IR780+PDT 组相比，PFOB@LIP-IR780+PDT 组表现出更强的肿瘤抑制效果。

2.1.3 改善声动力疗法疗效 声动力疗法（sonodynamic therapy，SDT）利用超声选择性地激活肿瘤内声敏剂与氧气之间的反应以产生活性氧，例如1O2和羟基自由基，导致肿瘤细胞凋亡和坏死。实体瘤的乏氧环境限制了SDT 的抗肿瘤效果[36]。为了克服这一问题，Zeng Q等[36]以光敏剂原卟啉（PpIX）修饰的氟化阳离子聚合物为外壳[PAsp（DET）-PpIXPEG]，制备了携氧的PFH 纳米乳[PAsp（DET）-PpIX-PEG@PFH@O2]。该纳米乳可以通过缓解肿瘤缺氧来降低治疗抵抗力，增强SDT 治疗效果。药效学结果显示，在超声作用下，PAsp（DET）-PpIXPEG@PFH@O2组比PAsp（DET）-PpIX-PEG 表现出更强的肿瘤抑制作用。另外，即使未预充氧的条件下，PAsp（DET）-PpIX-PEG@PFH 也表现出更强的肿瘤抑制效果，这表明了该纳米乳还可以在肺毛细血管或血管中进行氧合，通过实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）蓄积在肿瘤部位，在超声作用下迅速释放氧气，缓解缺氧并增强SDT 治疗效果。

2.2 构建相变纳米液滴

相变纳米液滴是指PFC 纳米乳受到超声或激光提供的足够能量时，稳定的液态核会相变为气态并发生体积膨胀。根据提供的能量来源不同，相变纳米液滴可分为声滴汽化（acoustic droplet vaporization，ADV）和光滴汽化（optical droplet vaporization，ODV）[37]。当外界的压力小于液体核心的PFC 蒸汽压时，PFC 会发生从液态到气态的相变，超声或者激光的能量可以将PFC 液体核心周围的压力降低至蒸汽压以下，从而诱导PFC 的相变[38]。因此，由于对超声或激光具有良好的敏感性，PFC 纳米乳在肿瘤的治疗和诊断方面引进了极大的关注，目前主要应用于肿瘤成像和药物递送两个方面。

2.2.1 肿瘤成像 超声成像是目前使用最广泛的医学成像方式之一，具有灵敏度高、安全性高、成本低等优点。超声造影剂也被称为声学增强剂，通常是直径为1～8 μm 的充满气体的微泡，其在与超声波相互作用时可以产生共振现象，从而增强超声的反射信号[37]。然而肿瘤新生血管系统只允许小于700 nm 的颗粒通过，一般情况下粒径小于200 nm的纳米粒更容易通过EPR 效应在实体瘤内蓄积，所以目前微米尺寸的微泡造影剂无法外渗到血管系统之外，仅能用于血池造影，不能用于实体瘤的造影[29]。与微泡相比，PFC 纳米乳具有纳米级的粒径，能够穿过内皮间隙并蓄积在肿瘤部位或病变组织中；同时，其适宜的沸点使纳米液滴在血液循环中保持其形状和粒径，暴露于高能量下时发生汽化，从而在肿瘤部位或病变组织中产生微米级的气泡、恢复其回声性[25]。因此，具有粒径转变特性的PFC纳米乳在肿瘤成像领域展示出巨大的潜力。Rapoport N等[39]最早使用PFC 纳米乳作为超声造影剂进行肿瘤成像，其开发的第一代纳米超声造影剂分别以包载阿霉素的两亲性嵌段聚合物和PFP（沸点为29℃）作为外壳和核心，由于拉普拉斯压力的作用，该纳米乳在体温下能维持纳米级的液滴状态，经超声作用转变成微泡进行肿瘤成像。

除了对肿瘤进行超声成像外，PFC 纳米乳还可以联合其他成像方式进行多模态成像。Maghsoudinia F等[40]将小分子造影剂Gadovist 负载到PFH纳米乳的藻酸盐聚合物壳中，在纳米乳超声成像的基础上增加了磁共振成像模式，弥补了超声成像低空间分辨率的缺点。另外，还可以通过在配方中添加光敏剂来制备用于光声和超声双成像模式的纳米乳。Zhu HR等[22]在全氟己烷纳米乳的聚多巴胺外壳表面吸附光敏剂IR820，聚多巴胺外壳可以促进IR820 荧光猝灭和非辐射弛豫，提高光声成像能力，实现光学成像高对比度、超声成像高分辨率和深层组织穿透性的结合。

2.2.2 药物递送 在超声作用下微泡表现出 “震荡”“扩大”“收缩”以及“内爆”一系列动力学过程，同时伴随发生微束、冲击波和微射流等激烈过程，此现象为声空化效应。声空化效应可分为惯性空化和非惯性空化。前者是指高强度超声引起微泡的迅速膨胀和爆破，从而产生强烈的冲击波和局部高温高压；后者则是指低强度超声引起微泡小范围内的收缩和膨胀，从而增强内部气体向外扩散的速率[41]。PFC 纳米乳相变转化成微泡时，声空化效应显著增强。一方面，在超声场中机械力作用下，PFC 微泡生长和破裂的惯性空化作用可产生冲击波和微射流，在细胞膜和血管中形成气孔，从而增加药物的渗透。另一方面，当超声能量不足以产生惯性空化时，非惯性空化作用可使血管壁产生交换性膨胀和内陷，增强血管的渗透性和内皮内膜的损伤，从而提高药物的递送效率[42]。此外，PFC 纳米乳的汽化只会在声学特性最强的焦点区域产生，因此可以保证药物在靶部位释放，从而减轻常规化疗药物对健康细胞的毒性作用。

基于以上优点，相变PFC 纳米乳广泛应用于药物递送系统的研究中。Baghbani F等[43]制备了海藻酸盐PFH 纳米乳，同时负载化疗药物阿霉素和化疗增敏剂姜黄素用于治疗卵巢癌（Dox-Cur-NDs）。研究发现，低频超声能够促进阿霉素和姜黄素的释放，显著增加了Dox-Cur-NDs 的细胞毒性。药效学实验结果显示，与Dox-Cur-NDs 组相比，Dox-Cur-NDs 联合超声治疗组表现出更强的肿瘤抑制作用。除了化疗药物外，相变PFC 纳米乳也可以用于核酸类药物的递送。Lee JY等[44]以壳聚糖脱氧胆酸为外壳，以PFP 为核心，通过静电结合吸附小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）于纳米乳表面，并包载氧化铁制备PFP 纳米乳（CND/siRNA）。研究发现，在超声作用下，该纳米乳能够促进siRNA 的细胞摄取，显著增加了肿瘤细胞杀伤效果。

3 总结和展望

由于PFC 纳米乳优异的特性，在肿瘤的治疗和诊断中具有很大的应用前景，然而尚未应用到临床中，还存在一定的局限性。在未来的研究中，还需要重点考虑以下几个方面：首先，虽然PFC 纳米乳的稳定性相比微泡大大增强，但与固体颗粒相比，纳米乳的稳定性仍然相对较差，在到达靶组织之前可能会经历聚结或过早相变[45]。因此，应进一步研究其不稳定性机制以及外壳性质对稳定性的影响，以开发出具有良好稳定性和均匀尺寸的PFC 纳米乳的处方工艺；其次，由于单一PFC 纳米乳对人体内部温度和压力变化不具有良好的敏感性，很难控制纳米乳的相变阈值以确保其在超声或激光作用下发生相变。使用混合全氟化碳作为核心制备纳米乳可以更好地控制相变阈值[46]，但需要进一步研究以确定最佳的全氟化碳组合以及发生相变的确切阈值；另外，当PFC 纳米乳应用于抗肿瘤缺氧时，PFC 的过量摄取可能会抑制网状内皮系统吞噬作用，同时，氧浓度持续升高可能会引起肺或其他器官的氧中毒[12]。因此，应系统研究PFC 纳米乳的作用时间、给药剂量和给药频率，以减少其临床转化的安全隐患；最后，关于PFC 的药动学行为和体内代谢行为的研究较少，应进一步加强该方面的研究，以更好地为人体研究和临床转化提供参考。