癫痫患者单用奥卡西平时其活性代谢产物血药浓度的影响因素分析*

黄 蕾，沈 凯，赵 诚，李文玲

南通大学附属医院 药学部,南通226001

癫痫是一种以大脑皮质神经元高度同步化放电为基本病理生理基础的慢性脑部疾病。我国癫痫的患病率达3.6‰～4.4‰，每年新增40 万～60 万例[1]。奥卡西平（oxcarbazepine）是一种前体药物，本身无活性，口服后，在体内经过肝脏细胞迅速降解为活性代谢产物10，11-二氢-10-羟基卡马西平（10，11-dihydro-10-hydroxycarbamazepine，简称10-羟基卡马西平）而发挥抗癫痫作用。后者大部分通过弱诱导的微粒体二磷酸尿苷-葡萄糖醛酸转移酶（uridine diphosphate -glucuronyltransferase，UDP -UGTs）转化为葡萄糖醛酸酯结合物而经肾脏排出[2]。由于外周血中仅有少量的奥卡西平，而主要以10-羟基卡马西平的形式存在，故临床常以10-羟基卡马西平的血药浓度代替奥卡西平监测治疗情况。

在奥卡西平治疗癫痫患者的临床实践中发现，奥卡西平的每日维持剂量和10-羟基卡马西平血药浓度存在较大的个体间变异。通常，临床予以初始剂量，依据患者的疗效与毒性反应以及血药浓度水平及时调整剂量。但在调整过程中，易发生癫痫发作未受控制而加剧病情，初始浓度过高导致药物不良反应等问题。癫痫患者的非遗传因素与遗传因素都有可能是导致奥卡西平药代动力学变异的重要因素。UGTs 酶是一个关键蛋白超家族，可使多种药物葡萄糖醛酸化，而大部分10-羟基卡马西平是通过肝脏中的UGTs 代谢的。肝细胞核因子4ɑ（hepatocyte nuclear factor4ɑ，HNF4ɑ）属于核内激素超家族，在肝脏中高表达并广泛参与肝脏发育、分化成熟的过程。此外，HNF4ɑ 通过调控UGTs、细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）和磺基转移酶等基因而在药物代谢控制中起关键作用。本研究结合患者的身高、体重、身体质量指数（body mass index，BMI）、年龄、性别、体表面积（body surface area，BSA）等方面研究其对10-羟基卡马西平血药浓度的影响，同时，分析UGT 家族中UGT1A9 I399 T ＞C（rs2741049）、UGT2B15 D85Y（rs1902023）的位点以及HNF4α 基因（rs2071197）位点的多态性与10-羟基卡马西平血药浓度的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

纳入2021 年10 月～2022 年8 月于本院就诊的汉族癫痫患者共66 例。

纳入标准：①经发作史、脑电图、实验室检查等确诊为癫痫的患者；②奥卡西平单药治疗；③肝肾功能正常。排除标准：①用药依从性差、不配合随访的患者；②合并有其他严重疾病者；③妊娠期及哺乳期妇女。

1.2 给药剂量与方法

门诊与住院患者均予以奥卡西平（曲莱，诺华制药，150mg/片）口服给药，成人起始剂量300mg·d-1，分2 次口服给药，逐渐加量至有效剂量维持。儿童（年龄＜18 岁）按照8～46mg·kg-1·d-1[3]，分2 次口服给药。

1.3 血药浓度检测方法

连续服用奥卡西平3 d 以上的患者血药浓度达稳态后，在次日服药前取血。已有文献报道[4-6]，检测奥卡西平与其代谢物10-羟基卡马西平的方法包括高效液相色谱法（HPLC）法和液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法。本研究采用HPLC 法测定10-羟基卡马西平的稳态血药谷浓度。

色谱条件：色谱柱Angilent C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相：25 mmol·L-1磷酸二氢纳缓释液:乙腈（70∶30）；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL；流速：1 mL·min-1。

标准储备溶液的配制：称取10-羟基卡马西平对照品（上海乐研公司，批号1100104，纯度约98%）约10 mg，精密称定，用1 mL 甲醇溶解，得10 mg·mL-1标准储备溶液。以10-羟基卡马西平高（80 μg·mL-1）、中（10 μg·mL-1）、低（2 μg·mL-1）3 个浓度为质控样品。

血清样本的处理：血浆样本于4℃下以3500 r·min-1离心10min，精密吸取血清100μL，加入乙腈300μL，涡旋振荡5min，以14000r·min-1离心10min；吸取上清液300 μL，以14 000 r·min-1离心5 min，取上清液200 μL 备用。

1.4 基因检测

取EDTA 抗凝的全血样品200 μL，按照Ezup柱式血液基因组DNA 抽提试剂盒说明书进行全基因组DNA 提取。DNA 质量检测如下：①取5 μL DNA 溶液1%琼脂糖、1×TAE 缓冲溶液电泳（电压120～180 V）检测，单一条带说明DNA 完整无降解，有明显的条带说明浓度可以满足PCR 要求；②分光光度计检测浓度和纯度，取1 μL 检吸光度A，A260/280在1.7～2.0，说明DNA 质量较好，小于1.7 有蛋白污染，大于2.0 有RNA 污染。采用Primer Premier 5 软件设计引物，见表1，一般参数如下：引物长度18～30 bp、Tm值55～65℃、退火温度60℃左右、GC 含量40%～70%、位点测序引物150～300 bp 左右，离位点80～150 bp，外显检测引物离外显子上下游150 bp左右、目的基因测序的PCR 产物条带一般不超过1200bp。使用美国ABI 的PCR 仪，PCR 反应体系：1μL 模板DNA、10μmol·L-1引物F 1μL、10μmol·L-1引物R 1 μL、10 mmol·L-1Dntp（mix）1 μL、10X Taq Buffer（with MgCl2）2.5μL、5U·μL-1Taq 酶0.2μL、ddH2O 25 μL。PCR 反应条件：95℃预变性5 min、94℃变性30 s、63℃（每循环降0.5℃）退火30 s、72℃延伸30 s、10 个循环；95℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s、30 个循环；72℃修复延伸10 min、4℃保温。PCR 产物取5μL 以1%琼脂糖凝胶电泳（150V、100 mA、10～20 min）分离。目的PCR 条带切胶回收，在result group 中寻找结果，并使用Sequence analysis 软件进行分析。

表1 引物序列

1.5 数据处理与统计分析

采用SPSS 26.0 统计分析软件进行数据整理与分 析，Graghpad Prism 5 绘制图形。通 过Kolmogorov-Smirnov 检验进行正态性验证，符合正态分布的两组间比较选用t 检验，不符合正态分布的采用Wilcoxon 秩和检验。对于相关性分析采用Pearson 和Spearman 相关性分析，以P ＜0.05 作为显著性差异的标准。根据Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，采用χ2检验进行分析，若P ＞0.05，则代表人群具有群体代表性。

2 结果

2.1 临床相关因素与10-羟基卡马西平血药浓度的关系

纳入的66 例患者均为奥卡西平单药服用患者，且至少进行了一次血药浓度监测。分别对给药剂量、年龄、性别、身高、体重、BMI 和BSA 与10-羟基卡马西平的血药浓度进行相关性分析，各因素统计数据见表2，结果发现，给药剂量与10-羟基卡马西平血药浓度呈正相关（P=0.000 4，r=0.455 6），见图1；年龄、BSA、身高与10-羟基卡马西平校正血药浓度呈正相关，见图2。

图1 10-羟基卡马西平血药浓度与给药剂量的相关性

图2 10-羟基卡马西平血药浓度与变量间的相关性

表2 各因素统计数据

2.2 基因多态性对10-羟基卡马西平血药浓度的影响

根据Hardy-Weinberg 遗传平衡定律：UGT1A9（rs2741049）、UGT2B15（rs1902023）、HNF4α（rs2071197）3 个SNPs 的基因型进行卡方检验，结果显示P ＞0.05，故该人群具有群体代表性，详见表3。另外，为了探究基因多态性与10-羟基卡马西平血药浓度的关系，本研究将三个位点的不同基因型之间两两比较，结果发现UGT2B15（rs1902023）的CC 型与CA基因型间存在一定的差异（P=0.0348，t=2.185），见图3。有研究发现[7]，UGT2B15 的表达呈现性别依赖性调控，为了排除其他因素影响，将两组间的性别、年龄、身高、体重、BSA、BMI 进行了比较，结果显示差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

图3 不同基因型与校正浓度logCDR 的相关性

表3 基因型分布情况

3 讨论

奥卡西平是新一代广谱抗癫痫药，属于无活性的前体药物，通过肝脏的细胞溶质芳香酮基还原酶的作用，可快速转化为有药理活性的代谢产物10-羟基卡马西平[8]。目前奥卡西平作为部分性发作的一线药物，在儿童和成人癫痫患者中应用广泛。已有研究证实[9]，单药或联用奥卡西平在治疗儿童和成人部分性癫痫中都具有很好的有效性与安全性。关于体质量、性别、年龄、体表面积等因素与10-羟基卡马西平血药浓度的相关性研究也有少量发表，但是结论存在一定的差异。本研究发现年龄、身高、体表面积都与10-羟基卡马西平血药浓度存在一定的关系，这与Armijo JA等[10]的研究结果一致。但也有研究发现[11]，10-羟基卡马西平的血药浓度与年龄、体质量等并没有相关性。儿童处于快速生长发育时期，随着年龄增长，机体的代谢能力增强，而老年患者的代谢能力也逐渐减弱，所以年龄在一定程度上也反映了肝肾功能、体质量及局部血流灌注情况。而0～5 岁儿童的肝脏质量、体质量和血流水平较大龄儿童和成人要高得多，其代谢能力反而相对较高[12]。有文章报道[13]，6 个月至青春期的婴幼儿和儿童，其肝脏的代谢酶活性约为成人的2 倍；2～6 岁儿童的肾脏清除率约为成人的2倍[14]；而老年患者奥卡西平的清除率降低[15]。因此，有必要对使用奥卡西平的癫痫患者进行血药浓度监测。在针对儿童患者奥卡西平血药浓度影响因素的相关研究中，不同研究结果也存在一定差异，有研究表明性别、年龄与10-羟基卡马西平血药浓度无关[16]。同样，在另一项对217 例患儿10-羟基卡马西平的血药浓度研究[17]和Park KJ等[11]的研究也显示无统计学意义。但也有研究[18]表明10-羟基卡马西平的血药浓度与年龄和性别有关。导致上述研究结果差异的可能原因有不同研究样本量大小的不同、患者存在地域种族差异以及年龄分层等。本研究纳入的患者均为华东地区汉族人群，为了更好地了解华东汉族人群10-羟基卡马西平的血药浓度，还需进一步开展更大样本量的研究。

此外，奥卡西平的代谢和治疗效果可受到代谢酶、转运体和靶点的影响。有研究指出[19]，10-羟基卡马西平可分为S-型和R-型，比例约为4∶1，其中S-型葡萄糖醛酸化代谢酶是葡萄糖醛酸转移酶2 家族B15（UGT2B15），R-型则是葡萄糖醛酸转移酶1 家族A9（UGT1A9）和2 家族B7（UGT2B7）。UGTs 介导的葡萄糖醛酸化是人类以及其他哺乳动物中消除异生物和内生化合物的重要代谢途径[20]。人体内药物和内源性化合物的葡萄糖醛酸化速率存在个体间差异，因此同一药物在不同个体间的药物治疗量和毒性剂量有所差异，同样，疾病的易感风险也会存在个体差异。各种因素可能会导致葡萄糖醛酸化的变异性，包含了遗传多态性和由酶诱导或抑制而导致的药物间的相互作用[21]。近年来，UGTs 中超过200 个等位基因的多态性已被研究出对酶功能、细胞运输和基因表达具有特殊影响，进而影响药物在体内的作用[22]。过往研究表明[23-25]，亚洲人中的UGT1A4 142 T ＞G、UGT1A6 19 T＞G、UGT1A9 I399 C ＞T、和UGT2B15 253 T＞G 的等位基因频率高于其他人种。

本研究发现，10-羟基卡马西平的血药浓度在UGT2B15 rs1902023 不同基因型之间存在一定的差异，CC 型患者的血药浓度低于CA 型。相关研究报道较少，而UGT2B15 最初被认为在雄激素类固醇、药物代谢和其他异种生物制剂的葡萄糖醛酸化过程中起着重要作用[26]。此外，本研究并未观察到UGT1A9 rs2741049 与10-羟基卡马西平血药浓度间显著相关性，考虑到不同研究群体的局限性，仍需要进一步研究。同样，本研究结果显示HNF4α rs2071197 的多态性与10-羟基卡马西平血药浓度无关，这提示HNF4α rs2071197 基因的多态性可能不参与奥卡西平单药治疗的癫痫患者中奥卡西平的代谢与转运。

本研究也有一定局限性，多种因素可能影响10-羟基卡马西平的血药浓度，如其他SNPs 可能的影响。由于单独使用奥卡西平治疗的癫痫患者样本量较小，有待于更大样本、多中心联合的进一步研究，以及不同种族、不同年龄段的细分。本研究表明了10-羟基卡马西平血药浓度与年龄、BSA、身高存在一定的关系，另外，UGT2B15 rs1902023 不同基因型间与10-羟基卡马西平的血药浓度相关，这可能有利于临床医师在观察临床症状的同时，结合血药浓度结果，制定出符合个体特点的给药方案，提高有效性和安全性。