HPLC法测定艾拉戈克钠原料药中手性异构体的研究

张高雅，厉廷有*，田帅华，刘红伟，何苏云

1南京医科大学 药学院,南京 211166;2江苏奥赛康药业有限公司,南京211112

艾拉戈克钠（elagolix，商品名Orilissa®）是由美国艾伯维公司研发并于2018 年经FDA 批准上市的小分子促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）受体拮抗剂，用于治疗子宫内膜异位症引发的中度和重度疼痛[1，2]。艾拉戈克钠通过与垂体中的GnRH 受体竞争性结合，抑制内源性GnRH 信号传导，可减少卵巢性激素的分泌，达到治疗子宫内膜异位症的目的[3，4]。相关临床试验表明[5]，艾拉戈克钠可显著改善由于子宫内膜异位症引发的痛经和非经期疼痛，连续使用6 个月，可降低患者子宫内膜厚度。此外，艾伯维公司公布的Ⅲ期临床数据显示，艾拉戈克钠在治疗子宫肌瘤引发的月经大出血方面也具有良好的疗效[6]。

艾拉戈克钠化学名为4-（{（1R）-2-[5-（2-氟-3-甲氧苯基）-3-{[2-氟-6-（三氟甲基）苯基]甲基}-4-甲基-2，6-二氧代-3，6-二氢嘧啶-1-基]-1-苯乙基}氨基）丁酸钠[3]，具有一个手性中心，应对其手性异构体进行限度控制（图1）。目前国内外未见关于艾拉戈克钠手性异构体研究的相关文献，鉴于此，本研究建立了艾拉戈克钠原料药中手性异构体的高效液相色谱检查法（HPLC），以期为该药品质量控制提供参考。

图1 艾拉戈克钠（A）及其手性异构体（B）结构式

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XSE205DU 电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，十万分之一）。

1.2 试剂

甲醇、乙腈（色谱纯，北京百灵威）；甲酸、二乙胺（分析纯，南京化学试剂有限公司）；艾拉戈克钠手性异构体对照品（批号S19121204，含量96.6%）、艾拉戈克钠对照品（批号S20022401-3，含量98.4%）、艾拉戈克钠样品（批 号S20071502、S20112701、S20092702-3）均购自江苏奥赛康药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

CHIRALPAK ZWIX（-）（4 mm×150 mm，3 μm）色谱柱（硅胶表面共价键合-奎宁（8R，9S）-（1R，2R）-环己基氨基磺酸衍生物）；甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺（170∶810∶20∶0.38∶0.52）流动相；流 速0.5 mL·min-1；运行时间20 min；检测波长270 nm；柱温25℃；自动进样盘温度5℃；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取艾拉戈克钠异构体对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成浓度为5 μg·mL-1的溶液。

系统适用性溶液：取艾拉戈克钠对照品适量，精密称定，加异构体对照品溶液溶解并定量稀释制成艾拉戈克钠浓度为1 mg·mL-1、艾拉戈克钠异构体浓度为5 μg·mL-1的混合溶液。

供试品溶液：取艾拉戈克钠样品（批号S20071502）适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成浓度约为1 mg·mL-1的溶液。

2.3 专属性试验

精密量取供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液及乙腈各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2。艾拉戈克钠及其手性异构体的保留时间分别约为7.2 min 和9.3 min，两色谱峰分离度约为4.0，理论塔板数均大于3000，乙腈无干扰，表明该方法专属性良好。

图2 专属性试验HPLC 图谱

2.4 定量限和检测限的测定

艾拉戈克钠异构体的检测限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）按“2.1”项下色谱条件，根据信噪比法用乙腈逐级稀释对照品溶液进行测定。结果测得艾拉戈克钠异构体的LOQ（信噪比为10∶1）约为0.25 μg·mL-1，LOD（信噪比为3∶1）约为0.1 μg·mL-1。

2.5 线性关系考察

取艾拉戈克钠异构体对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成浓度分别2.5、4.0、5.0、7.5 和10 μg·mL-1的系列艾拉戈克钠线性试验溶液，按“2.1” 项下色谱条件，精密量取线性试验溶液和“2.3”项下LOQ 溶液各10 μL 进样分析，记录谱图。以峰面积响应（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg·mL-1）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.422 9X-0.136 6（r=0.999 1），在0.25～10 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.6 溶液稳定性

按“2.2”项下方法配制系统适用性溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h 取样，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录艾拉戈克钠异构体峰面积。结果表明，系统适用性溶液艾拉戈克钠异构体峰面积RSD 为1.3%，对照品溶液峰面积的RSD 为0.81%，供试溶液均未检出艾拉戈克钠异构体。确证系统适用性溶液、对照品溶液和供试溶液在5℃条件下保存稳定性良好。

2.7 回收率实验

取艾拉戈克钠异构体对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成浓度为25 μg·mL-1的对照品贮备液。精密量取对照品贮备液，加乙腈稀释10 倍制备定量限贮备液。另取本品约10 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，平行配制12 份，分为4组，第1 组分别精密加入定量限贮备液1 mL，第2～4 组分别精密加入对照品贮备液1、2、4 mL，再分别加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果见表1。

表1 异构体检查回收率试验结果

结果表明，测得不同限度水平艾拉戈克钠异构体的加样回收率在94.33%～109.1%之间，RSD ＜10%，方法回收率良好。

2.8 精密度实验

2.8.1 进样精密度试验 精密量取“2.2”项下对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。连续进样6 次，考察方法的进样精密度。结果表明，艾拉戈克钠异构体峰面积RSD 为0.84%，方法进样精密度良好。

2.8.2 加标重复性试验 按“2.7”项下0.5%限度水平配制回收率溶液，平行6 份。按“2.1”项下色谱条件测定，采用外标法计算异构体含量，见表2。

表2 异构体检查加标重复性试验结果

2.9 耐用性实验

精密量取对照品溶液和系统适用性溶液各10 μL，分别进样，考察柱温、流速、波长以及流动相组成等微小变动对检查结果的影响。结果表明，上述条件发生微小变化时，对异构体的检出量和分离度均无明显影响，方法耐用性良好，见表3。

表3 异构体检查耐用性实验结果

2.10 样品测定

取3 种不同批次艾拉戈克钠原料药（批号S20071502，S20112701，S20092702-3）及其影响因素试验（5、10、30 d）样品，按“2.2”项下供试品溶液方法配制该批次样品溶液及对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，采用外标法计算各批次异构体含量，结果均未检出异构体杂质。

3 讨论

本研究建立了测定艾拉戈克钠原料药中艾拉戈克钠手性异构体的HPLC 方法，使用两性离子交换柱进行分离。该方法专属性强、灵敏度高、准确性好，可对艾拉戈克钠原料药中的艾拉戈克钠异构体含量进行准确测定，为确保药品质量提供了重要的依据。

本研究进行色谱柱筛选时，首先考虑正相色谱使用手性柱进行实验。结果发现，正相色谱的手性柱色谱图出现比例约为1∶1 的双色谱峰，且峰形较差，推测是艾拉戈克钠及其异构体存在旋阻异构造成的结果。艾拉戈克钠化学结构中含有一个仲胺和一个羧基基团，其结构与氨基酸较为类似，尝试使用兼容反向色谱的两性离子交换柱进行分离。采用日本DAICEL 公司开发的CHIRALPAK ZWIX 离子交换色谱柱，通过键合具有手性结构的奎宁衍生物，达到对两性手性氨基酸分离的目的。结果表明用该色谱柱分离艾拉戈克钠及其异构体效果良好。CHIRALPAK ZWIX 具有（+）和（-）两种类型，其键合的奎宁衍生物的手性碳手性构型相反，尝试用两种类型色谱柱进行分离，使用CHIRALPAK ZWIX(+) 柱其空白溶剂在异构体峰处有干扰，因此选择CHIRALPAK ZWIX（-）柱进行检测。

参考DAICEL 公司关于CHIRALPAK ZWIX（-）柱的说明书，其流动相含有20%左右的甲醇以提供质子。同时作为离子交换柱，流动相中应添加适当的酸碱添加剂组合以促进待分离物的解离，推荐使用甲酸-二乙胺（摩尔比2∶1）作为离子对添加到流动相中。甲醇比例过高，虽然会达到更好的分离效果，但其保留时间也会相应缩短，耐用性的考察结果也证明了这一点。在选择20%以上甲醇比例的流动相时，艾拉戈克钠及其异构体的保留时间出现明显下降。为保证艾拉戈克钠峰能在色谱柱中适宜的保留和方法耐用性，最终优化确定甲醇占比为17%流动相甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺比例（170∶810∶20∶0.38∶0.52）进行测定。

对艾拉戈克钠及其异构体的对照品进行190～400 nm 全波长扫描，均在270 nm 附近有特征吸收（图3），为了避免流动相本底干扰，选择此波长进行检测。

图3 全波长扫描图