新疆地区原发性肝癌肿瘤同时性转移基因差异表达*

张丽萍，马晓丽，卢晓梅，孙刚，张莉，姚文兵

1新疆医科大学 药学院，乌鲁木齐 830011；新疆医科大学第一附属医院 2综合内四科;3临床研究院，乌鲁木齐 830054；4新疆医科大学附属肿瘤医院 乳腺甲状腺外科，乌鲁木齐 830000；5新疆医科大学第一附属医院 综合内一科，乌鲁木齐 830000；6中国药科大学 生命科学与技术学院，南京210009

原发性肝癌是世界范围内最常见的肿瘤之一，尤其在发展中国家，其发病率持续上升[1]。我国肝癌发病人数和死亡人数约占全球一半，特别是作为多民族聚居地的新疆地区，其高发病情况呈现独特地域特色[2]。导致肝癌具有较高病死率的原因是病灶的复发和转移，但肝癌转移的机制尚不清楚[3，4]。

肿瘤异质性表现为病理类型的不同，对手术、放疗和化疗等治疗敏感性不同，以及患者预后的差异[5]。在研究原发性肝癌伴肝外恶性肿瘤中发现其具有原发性肝癌的基本特征，可为早期诊治提供可能[6]。因此，研究肿瘤异质性对指导肝癌诊断和治疗具有重大意义。本研究基于下一代测序技术（nextgeneration sequencing，NGS），通过检测配对的原发灶和转移灶基因突变的异同，分析原发灶与转移灶之间基因突变的差异、所涉及的信号通路和药物作用靶点，以期为肝癌的精准治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床病例

收集新疆医科大学第一附属医院2018 年1 月～2021 年5 月经病理证实为首次出现同时性转移的原发性肝癌且术前未经放化疗及生物免疫治疗的组织蜡块。肝癌同时性转移是指转移灶和原发灶同时发生或根除术后6 个月内发生转移。共收集原发灶及配对转移灶标本21 例（汉族15 例、维吾尔族3例和哈萨克族3 例），其中肝内转移3 例，肝门淋巴结转移3 例，脾动脉周围淋巴结转移3 例，肛门部淋巴结转移6 例，膈肌转移3 例，肾上腺转移3 例。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 的提取 将切片去除多余的石蜡，按照Qiagen 公司的QIAamp DNA FFPE 组织提取试剂盒提取，得基因组DNA。

1.2.2 NGS 突变检测 将已提取的DNA 标本取出，使用Ion Torrent PGM 二代测序平台检测原发灶和转移灶相关基因的突变基因。

1.2.3 生物信息学分析 以ProtonTMTorrent 服务器预加载Torrent Suite 软件，对外显子测序数据进行数据分析，作覆盖分析、变异识别等检测，用FPKM法计算样本的表达量，Fold-change 法分析基因的差异表达，发现新基因后，用Ion ReporterTM软件进行生物学功能注释和常见变异体的鉴定，并对差异表达进行聚类分析、KEGG Pathway 功能富集分析。

1.2.4 统计学分析 应用SPSS 26.0 软件分析数据，并用Kaplan-Meier 单因素生存分析统计患者基因突变及临床资料与总生存期（overall survival，OS）间的相关性，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

1.2.5 随访 采用电话或门诊的随访方式，对筛选的21 例患者随访至2022 年2 月，主要终点事件为患者死亡，次要终点事件为随访时间截止、随访期间内发生其他脏器功能衰竭难以配合后续随访工作。

2 结果

2.1 原发灶和转移灶的基因特征

原发性肝癌标本中原发灶和转移灶共同显示出突变率最高的10 种基因：MUC16（43%）、TTN（36%）、ZAN（29%）、MYO18B（29%）、DNAH7（29%）、DNAH10（29%）、DMLX2（29%）、DCC（29%）、CSMD1（29%）、CDLSR2（29%）。原发灶和转移灶之间异质性不明显（P＞0.05）。转移灶中基因突变率高于原发灶。见图1。

图1 原发性肝癌标本中原发灶和转移灶共同突变的10 种基因

2.2 原发灶和转移灶基因突变类型

基因变异分类主要为错义突变，其次为无义突变，移码缺失、框内缺失、剪切位点突变、框内插入、移码插入的突变类型出现较少。进一步细分，又以基因组水平上单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性即（single nucleotide polymorphism，SNP）最多见，插入和缺失的突变类型占比极少。在碱基突变中，C ＞A 替换发生频率最高，C ＞T 替换的发生频率次之，C ＞G 替换、T ＞C 替换、T ＞G 替换、T ＞A替换的发生频率较低。这说明嘌呤与嘧啶之间的颠换高于嘌呤与嘌呤之间的转换。见图2。

图2 原发性肝癌原发灶和转移灶基因突变类型

2.3 基因突变与临床特征的关系

TTN 基因突变与性别、族别、分化程度相关（P ＜0.005），与年龄不相关（P ＞0.05），见表1；MYO18B基因突变与族别相关（P=0.043），与性别、年龄、分化程度不相关（P ＞0.05）；其余基因与性别、年龄、分化程度、族别均不相关（P ＞0.05），见表2。

表1 原发灶和转移灶中TTN 突变与临床特征的关系

表2 原发灶和转移灶中MYO18B 突变与临床特征的关系

2.4 原发灶与转移灶突变基因的共存和互排情况

在突变率最高的前10 个基因里，原发灶中TTN 与ZNF208、ZDBF2、VCPIP1、USP34 存在强烈的突变共存现象并表现出相关性；转移灶中HHIPL2 与MYO18B、ADCYAP1 与MUC16 分别存在强烈的突变共存现象并表现出相关性。见图3。

图3 原发性肝癌原发灶（A）和转移灶（B）基因共存

2.5 基因突变与生存的关系

随访至2022 年2 月，21 例患者中3 例存活至今，18 例生存期为6～10 个月，中位生存期为7 个月。TTN 突变（P=0.023）与原发性肝癌患者的OS相关，表明TTN 突变可能是影响原发性肝癌术后患者预后的独立因素，TTN 突变使患者的生存期缩短。性别、年龄、民族、T 分期、淋巴结转移数目、远端转移数目、MUC16 突变、MYO18B 突变、CSMD1 突变与OS 均无显著相关性。见图4。

图4 MUC16、TTN、MYO18B、CSMD1 突变生存函数单因素分析

2.6 基因突变涉及的原发灶和转移灶共同的信号通路及基因变异数

本研究检测出8 种信号通路，见图5。

图5 原发性肝癌信号通路基因变异数

2.7 原发灶与转移灶中突变基因的药物作用靶点

原发灶和转移灶中突变基因的共同药物作用靶点有10 个，分别是可成药基因组（druggable genome）、丝氨酸/苏氨酸激酶（serine threonine kinase）、离子通道（ion channel）、肿瘤抑制因子（tumor suppressor）、酪氨酸激酶（tyrosine kinase）、DNA 修复因子（DNA repair）、复杂转录因子（transcription factor complex）、转录因子结合位点（transcription factor binding）、肿瘤治疗靶点基因组（clinically actionable）、ABC 转运体（ABC transporter）。见图6。

图6 原发性肝癌原发灶（A）和转移灶（B）中突变基因的药物作用靶点

3 讨论

本研究结果显示原发灶和转移灶异质性不明显，其原因可能为本纳入的对象均为初次诊断原发性肝癌同时性转移，未经放化疗、免疫治疗，属于肝癌早期转移，且大部分为区域淋巴结转移及局部侵犯，远处转移较少。有研究发现[7，8]，多发肝癌中原发肿瘤、门静脉癌栓及肝内转移具有相似的基因表达图谱，这与本研究一致，因此，实验后期会跟进随访，对存活患者加入肝癌远端转移的研究，原发灶与远端转移灶的NGS 测序结果，进一步探寻肿瘤的异质性。由于原发灶和转移灶同时发生或者两者发生时间间隔较短，所以肝癌干细胞的自我更新和分化程度可能相对较低，这也是肝癌肿瘤异质性不明显的原因之一。

MUC16 在肝癌的发生发展中发挥重要作用，本研究中MUC16 的突变率最高，达43%。有研究表明MUC16 在肝癌组织中的表达高于正常组织，且该基因与肝癌患者的总生存相关[9]。本研究发现原发性肝癌少见且与预后相关的突变基因TTN。Zou S等[10]也研究发现，TTN 基因在肺鳞状细胞癌中异常表达，TTN 突变可能是肺鳞状细胞癌发的预后因素。本研究还发现原发性肝癌少见突变基因MYO18B 和CSMD1。Edakuni N等[11]研究表明MYO18B 的体内表达抑制SCID 小鼠中人恶性胸膜间皮瘤细胞的生长，提示MYO18B 具有肿瘤抑制作用。有研究表明[12]，CSMD1 基因缺失与乳腺癌、肺癌、前列腺癌和头颈癌的发生发展有关。

已有许多基因检测发现癌症的发生是基因共同突变导致的，而不是单个基因决定的。本研究发现了原发性肝癌中存在多个突变共存的基因，同样验证了这一观点。研究证明ADCYAP1 基因参与各种发育过程，并且发挥着神经激素、神经调节递质、神经营养因子的作用[13]。此外ADCYAP1 基因调控大脑中谷氨酸能神经元[14]，与创伤后压力综合征有关[15]，该基因也是大脑压力网络中的重要组成部分[16]。因此，ADCYAP1 基因突变与MUC16 基因突变协同作用可能会促进肝癌细胞的迁移，促进肿瘤的发展。本研究中肝癌原发灶中的TTN 基因与ZNF208、ZDBF2、VCPIP1、USP34 基因存在强烈的突变共存现象并表现出相关性。有研究发现[17]，在肺鳞状细胞癌患者中检测到TTN 基因和TP53 基因突变共存，并且此类肿瘤患者显示出更长的OS 和无病生存期，这表明TTN 基因和TP53 基因突变可能在肺鳞状细胞癌中具有协同作用，可以预测良好预后。因此，TTN 也可能与上述共突变基因在原发性肝癌中协同作用。在原发性肝癌还发现MYO18B 基因发生了突变，并且与转移灶中HHIPL2 基因存在强烈的突变共存现象以及相关性。但目前并未发现HHIPL2基因的过度表达与任何癌症相关，其确切的生物学功能尚不清楚，考虑到HHIP1 基因与Hedgehog 信号通路的蛋白质相互作用，HHIPL2 基因参与癌症的发生发展也可能与该通路有关[18]。因此，HHIPL2基因与MYO18B 基因在原发性肝癌中突变共存，可能与原发性肝癌的转移有关。

RAS 信号通路与细胞的增殖与生长关系密切。有研究表明[19]，Ras/Raf/Mek/Erk 信号转导通路广泛参与肝癌细胞的生长、转移等过程。目前，已有针对RAS 靶点的法尼基转移酶抑制剂FTIs、针对B-Raf靶点的一代抑制剂索拉菲尼[20]上市。NOTCH 信号通路作用复杂，在单个肿瘤内可能同时具有致癌和抑癌的双重作用[21]。因此，针对该通路还要进一步研究。Hippo 信号转导通路失活时，可促进癌细胞存活、增殖、侵袭性迁移和转移，该过程可见于肝癌、肺癌、结直肠癌等多种癌症中，可导致化疗、放疗或免疫治疗耐药的发生[22]。本实验结果还涉及了WNT[23]、PI3K[24]、TP53[25]、MYC[26]、NRF2[27]信号通路，但突变基因在这些通路中富集较少。

通过DGIdb 数据库筛选出了原发灶和转移灶共同的10 个药物作用靶点。可成药基因组是指编码蛋白质、可用于药物靶标的基因集，其包含的基因较多，如突变基因ABCA13、ABCC8、ARSK 等，这些基因编码的蛋白质就可以针对肿瘤，确定药物作用的正确位点。同样，药物作用靶点是丝氨酸/苏氨酸激酶、离子通道、肿瘤抑制因子等的突变基因，也会因为氨基酸序列发生改变而影响药物在人体代谢过程，从而对药物与其作用靶点结合产生影响，最终影响药物效应。可以在此基础上将基因组与疾病关联起来，寻找更多有意义的药物作用靶点。

本研究尚存在不足，纳入的病例数量有限，增加样本数量，特别是发生远端转移患者的数据，将为原发性肝癌同时性转移异质性研究提供参考。