LC-MS/MS法测定大鼠血浆中亚胺培南浓度及其药动学研究*

钱敏燕，杨旭萍，蒋振伟，左李安，胡楠，王莉英

苏州大学第三附属医院/常州市第一人民医院 药学部，常州213003

亚胺培南（imipenem，IMP）是碳青霉烯类β-内酰胺类抗生素，对大多数革兰氏阴性、革兰氏阳性菌及厌氧菌具有抗菌活性[1]，与去氢肽酶抑制剂西司他丁联合使用可防止IMP 被肾脏脱氢肽酶Ⅰ（dehydropeptidase Ⅰ，DHP-Ⅰ）代谢[2]。作为时间依赖性抗菌药，IMP 游离药物浓度超过最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的给药间隔决定了其疗效，保持适当的药物浓度高于MIC 的时间（T ＞MIC）可达到最佳的抗菌效果[3]。

目前测定血浆中IMP 浓度的方法包括HPLC法和液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[4，5]。测定体内化合物时LC-MS/MS 法具有选择性好、灵敏度高以及分析时间短的优点。已有文献报道IMP 在不同种属体内的药代动力学参数[6，7]，给予不同剂量的IMP会对大鼠的肾脏产生损伤[8]，但目前有关不同剂量IMP 在大鼠中的药动学研究较少。本研究考察了3种不同剂量IMP 在SD 大鼠体内的药动学，为IMP相关研究提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 药品及试剂

注射用亚胺培南西司他丁钠（规格1 g，批号U035144，杭州默沙东有限公司），亚胺培南对照品（纯度98%，批号PNJX200214，深圳大力水手生物科技有限公司），法罗培南（faropenem，FARO）对照品（纯度80.3%，批号130532-201301，中国食品药品检定研究院）；乙腈（LC 级，批号JB091230，美国Merck公司），甲酸（纯度95%，批号SHBL0331）、乙酸铵（纯度98%，批号BCCB9398）购于德国Sigma 公司。

1.2 仪器

Triple QuadTM4500MD 三重四级杆串联质谱仪，Jasper 高效液相色谱系统（美国SCIEX 公司）；低温高速离心机5417R（德国Eppendorf 公司）；Vortex-Genie2 涡旋震荡仪（美国Scientific Industries 公司）；BT25S 电子分析天平（德国Sartorius 公司）；Milli-Q 纯水仪（美国Merck 公司）。

1.3 动物

18 只雄性SD 大鼠，体重300 g 左右，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（苏）2021-0013。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱条件：Phenomenex Kinetex®HILIC 柱（50 mm × 2.1 mm，2.6 μm）；流动相A：含0.1%甲酸和5 mmol·L-1乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱：0～0.7 min，95%B；0.7～1 min，95%→40%B；1～2.5 min，40%B；2.5～2.7 min，40%→95%B；2.7～5 min，95%B；流速：0.4 mL·min-1；进样器温度：4℃；柱温：40℃；进样体积：5 μL。

2.2 质谱条件

质谱条件：电喷雾离子化电离源（electrospray ionization，ESI），扫描方式为多重反应监测（multiple response monitoring，MRM），正离子模式；离子喷射电压：5500 V；离子源温度：500℃；雾化气（GS1）：344.7 kPa；辅助气（GS2）：344.7 kPa；气帘气（curtain gas）：206.8 kPa；亚胺培南、内标法罗培南离子对分别为m/z→300.0/142.0，m/z→308.0/182.0；解簇电压分别为55、53 eV；碰撞能量分别为21、24 eV。

2.3 溶液配制

称取IMP 对照品适量，精密称定，甲醇定容得1.00 mg·mL-1的IMP 储备液，分装后置于-80℃冷冻保存。

称取FARO 对照品适量，精密称定，甲醇定容得0.50 mg·mL-1内标储备液，稀释得50.0 μg·mL-1的内标工作液，分装后置于-80℃冷冻保存。

2.4 标准曲线和质控样品制备

用甲醇稀释IMP 储备液得2、5、10、20、50、100、200、500、1000 和2000 μg·mL-1的标准品溶液。另稀释IMP 储备液得定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）质控溶液（0.2 μg·mL-1）及低、中、高浓度质控溶液（3、150、1500μg·mL-1）。取45 μL血浆，加入5 μL 上述不同浓度的IMP 标准品溶液和质控溶液，得到终浓度为0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·mL-1的系列标准血浆样品，LLOQ 浓度（0.02μg·mL-1）以及低、中、高浓度（0.3、15.0 和150.0 μg·mL-1）的质控血浆样品。

2.5 血浆样本前处理

取血浆50 μL，加入5 μL 内标FARO（50 μg·mL-1），再加入150 μL 乙腈，涡旋振荡3 min，以16 400 r·min-1离心10 min，取上清液进样分析。样本从-80℃取出到处理完成至进样过程控制在2 h 内。

2.6 方法学验证

2.6.1 专属性 空白血浆、含FARO 的空白血浆、含IMP 标准品及FARO 的空白血浆以及给药10 min后大鼠血浆样品，均按“2.5”项下方法处理后进样分析，色谱图见图1。IMP 和FARO 的保留时间分别为2.40、1.14 min，血浆中杂质和内源性物质在IMP 保留时间内无干扰，说明该方法专属性良好。

图1 血浆样品亚胺培南与法罗培南的LC-MS/MS 色谱图

2.6.2 标准曲线和定量下限 取“2.4”项下制备的系列标准血浆样品，按“2.5”项下处理后进样，建立线性回归的标准曲线。待测物与内标物峰面积比Y为纵坐标，待测物浓度X（μg·mL-1）为横坐标，使用加权（W=1/X2）最小二乘法进行线性回归运算，得直线回归方程；采用内标法对IMP 进行定量。结果表明，IMP 在0.2～200 μg·mL-1内线性关系良好，直线回归方程为Y=2.44×10-3X-1.66×10-4，r2=0.996。LLOQ 为0.2 μg·mL-1（S/N ＞10）。

2.6.3 准确度和精密度 取“2.4”项下制备的LLOQ血浆样品（0.02 μg·mL-1）和低、中、高（0.3、15.0 和150.0 μg·mL-1）浓度的质控血浆样品各5 份，按“2.5”项下进行处理后进样分析，连续测定3 d，计算批内（n=5）和批间（n=3）精密度，结果见表1。

表1 亚胺培南测定方法的准确度以及精密度RSD（%）

2.6.4 基质效应和提取回收率 分别取50 μL 纯水和不同来源的空白血浆6 份，加入150 μL 乙腈沉淀，涡旋后分别加入“2.4”项下低、中、高浓度质控溶液（3、150、1500 μg·mL-1）和内标溶液，混匀后进样分析，记录纯水样本峰面积As和内标峰面积Ai之比（A），记录血浆样本峰面积A′s和内标峰面积A′i之比（B）。以峰面积比值计算基质效应，基质效应（%）=B/A×100%。

取50μL 不同来源的空白血浆6 份，加入150μL乙腈沉淀，涡旋离心后取上清，分别加入低、中、高浓度质控和内标溶液（使其浓度与低、中、高质控血浆样本浓度相同），混匀后进样分析，记录低、中、高浓度样本峰面积As和内标峰面积Ai之比（C）；取“2.4”项下低、中、高浓度质控溶液（3、150、1500 μg·mL-1），按“2.5”项下处理6 份样品，进样得到低、中、高浓度样本峰面积A′s和内标峰面积A′i之比（D）。以峰面积比值计算提取回收率，提取回收率（%）=C/D×100%。

QC 样品的基质效应为91.3%～104.6%，提取回收率为88.9%～101.6%，满足生物样品的分析要求。

2.6.5 稀释可靠性 取“2.4”项下低、中、高浓度的质控血浆样品各5 份，再用空白血浆稀释2 倍（稀释后的理论质量浓度为0.15、7.5 和75 μg·mL-1）后，按“2.5”项下处理后进样以考察稀释可靠性。经稀释后低、中、高浓度的质控血浆样品的准确度分别为（101.2±4.4）%、（98.0±11.8）%和（88.3±5.2）%，RSD分别为8.7%、12.1%和3.4%。

2.6.6 稳定性 取“2.4”项下低、中、高浓度的质控血浆样品5 份，考察样品在常温2 h，4℃放置4 h、-80℃冻融3 个循环、-80℃冻存10 d 以及处理后在自动进样器中放置4 h 的稳定性，结果见表2。

表2 亚胺培南测定方法的稳定性（n=5）

2.7 药动学研究

18 只雄性SD 大鼠分为3 组，每组6 只，注射用亚胺培南西司他丁钠用适量生理盐水溶解后，分别按50、100、200 mg·kg-1的剂量腹腔注射（intraperitoneal injection，ip），并于给药后10、20、40、50、60、75、90、120、240、360 min 从眼底静脉丛采血200 μL，置于肝素化离心管中，采血后立即以3000 r·min-1离心5 min，取上清50 μL 于-80℃保存，待测。测样时将样品置于4℃冰箱中解冻，按“2.4”项下处理后进样分析。200 mg·kg-1给药的大鼠血浆样品浓度超出标准曲线线性范围，加入等量大鼠空白血浆稀释，按“2.4”项下处理后进样分析。

所得数据用Winnonlin 6.0 软件处理，采用非房室模型计算药动学参数。SD 大鼠腹腔注射50、100和200 mg·kg-1IMP 后的平均血药浓度-时间曲线见图2，主要药动学参数见表3。

图2 SD 大鼠腹腔注射IMP 后的平均血药浓度-时间曲线

表3 SD 大鼠腹腔注射IMP 后主要药动学参数（n=6）

3 讨论

反相色谱柱对极性化合物的保留能力弱，因IMP为强极性化合物在反相色谱上常出现色谱峰拖尾的问题[9]。HILIC 色谱柱所用的流动相与反相色谱柱相似，但其极性固定相对亲水化合物的保留能力强于反相色谱柱，适用于分离强极性和亲水性化合物[10]。在HILIC 色谱中乙腈分离IMP 的效果比甲醇好，选用乙腈-水作为流动相时发现IMP 的响应偏低且峰型较差，故尝试在流动相中加入酸和挥发盐。结果发现在水相加入甲酸可提高IMP 的响应，加入乙酸铵可改变峰型，因此选择0.1%甲酸和5 mmol·L-1乙酸铵作为流动相进行梯度洗脱。

IMP 在生物样本中不稳定，此外pH 值和温度对其稳定性影响较大[11]；在偏碱性或酸性的条件下易生成开环降解产物；pH=1 时，高浓度IMP 还会降解生成稳定的二酮哌嗪结构化合物[12]。在IMP 检测相关文献中，常加入2-（N-吗啡啉）乙磺酸[2-（N-morpholine）ethylene sulfonic acid，MES] 或3-吗啉丙磺酸（3-morpholino propanesulfonic acid，MOPS）等非亲核试剂作为稳定剂[4，13]以提高其稳定性。但长期使用稳定剂会降低质谱灵敏度，对质谱造成损伤[14]。本文也考察了操作过程中影响IMP 稳定性的因素，不同条件下的稳定性均在可接受范围内，因此在本研究未使用稳定剂。在整个实验过程中需控制处理温度和时间以减少IMP 的降解，取血后需立即离心取上清置于-80℃中保存。另有研究显示未使用稳定剂的IMP 血浆样品（30 mg·L-1）可在室温下放置2 h、4℃下放置4 h 或-70℃下储存6个月[13]。

在临床剂量范围内IMP 的药代动力学是线性的[15]，本研究发现各组大鼠的Cmax（r=0.916，P ＜0.01）和AUC0-t（r=0.961，P＜0.01）与剂量呈线性相关。参考大鼠静脉注射（intravenous injection，iv）IMP（50 mg·kg-1）后所得AUC0-∞（7 713.89±2 608.39）μg·min·mL-1[16]，结合本研究的AUC 数据，计算得到绝对生物利用度为68.2%，与IMP 肌肉注射的生物利用度（70%～80%）[17]接近。Peng L等[16]研究了SD 大鼠经静脉注射IMP（50 mg·kg-1）的药动学参数，CL（0.007±0.002）mL·min-1·g-1、Vd（0.319 ± 0.18）mL·g-1、t1/2（29.295±12.972）min 及MRT0-∞（48.457±9.18）min与本研究结果较为一致，但AUC0-∞（7 713.89 ±2 608.39）μg·min·mL-1、Cmax（180.5±64.859）μg·mL-1和tmax（2.5±1.22）min 存在差异，因为ip 给药后药物需经腹膜吸收入血后再分布至全身。与本研究结果相比，Boulamery A等[18]研究了Wistar 大鼠给予IMP（im 140 mg·kg-1）的药动学参数，AUC0-∞（177.38±24.58）μg·h·mL-1和Cmax（85.94±19.71）μg·mL-1偏低，CL/F（0.27±0.04）L·h-1、t1/2（0.92±0.24）h 和V/F（0.37±0.13）L 可能是肌肉注射使IMP 的释放延长[19]。综上所述，本文建立了一种LC-MS/MS 法测定大鼠血浆中IMP 的浓度，比较了3 种不同剂量IMP在SD 大鼠体内的药动学参数，可以为IMP 在大鼠中的相关研究提供参考依据。