铁皮石斛通过GLUT4和HK2对肺癌及肺癌细胞糖酵解的影响机制*

杨应勇,刘杰,杨勇,梁妍**,周威**

(1.贵州神奇药业有限公司 贵州神奇药物研究院,贵州 贵阳 550004;2.贵州医科大学 药学院,贵州 贵阳 550025)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科属名贵药用植物,其主要的化学成分有联苄、菲类、生物碱、多糖等[1],研究表明铁皮石斛具有抗肿瘤、降糖、增强免疫力等药理活性[2-4]。肺癌是全球发病率最高的癌症,超过75%的肺癌患者会发展为晚期,5年生存率仅为5.2%。本课题组前期实验证明铁皮石斛提取物对人肺癌细胞的增殖具有明显抑制作用,且下调肺癌细胞能量代谢途径上游调控蛋白[5-7]。肿瘤细胞或组织表现出异常的能量代谢,即使是在氧气充足的条件下,快速生长的癌细胞仍依赖糖酵解来产生能量,这种独特的供能方式被称为瓦博格效应(warburg effect)或有氧糖酵解[8-10],这种异常的能量代谢方式被认为是肿瘤的标志之一,在肿瘤发生和转移中起关键作用,抑制糖酵解途径能为新型抗癌药物的研究开发提供有效途径[11-12]。铁皮石斛对实验动物、临床患者体内血糖水平平衡有良好的调控作用[13-15],鉴于此,本研究将从肿瘤糖酵解角度研究分析铁皮石斛抗肺癌的体内外作用及机制,为其开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株和动物 人肺癌A549细胞、小鼠肺癌LLC细胞由武汉益普生物科技有限公司提供。SPF级C57BL/6J雄性小鼠(6周龄,体质量18～20 g)购自贵州医科大学动物实验中心[动物证书编号SCXK(北京) 2019-0008]。

1.1.2药品与试剂 铁皮石斛购自贵阳太升中药材市场,经贵州医科大学生药学教研室刘绍欢副教授鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛,注射用环磷酰胺 (CTX,德国Baxter Oncology GmbH公司),RPMI 1640培养基、DMEM培养基和0.25%胰蛋白酶-EDTA酶购自Gibco公司,胎牛血清(FBS)购自武汉普诺赛生命科技有限公司,噻唑蓝(MTT)、彩虹180广谱蛋白Marker、乳酸含量检测试剂盒和葡萄糖含量检测试剂盒购自北京索莱宝公司,葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)、己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)、GAPDH和β-Actin购自武汉三鹰生物技术有限公司,M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)购自Cell Signaling Technology 公司。

1.2 研究方法

1.2.1铁皮石斛提取物制备 将1 000 g铁皮石斛以固液比1∶6浸泡在95 %乙醇中24 h,然后在80 ℃恒温水浴中乙醇冷凝回流提取3次,每次2 h,收集滤液,将其浓缩成无醇味浸膏,4℃保存,备用。

1.2.2细胞培养 人A549肺癌细胞和小鼠LLC肺癌细胞分别使用RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清和1%双抗)和DMEM安全培养基(含10%胎牛血清和1%双抗),置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度恒温培养箱培养。

1.2.3MTT比色法检测铁皮石斛提取物对A549细胞活力的影响 将对数生长期的A549细胞以8×103个/孔接种于96孔板中,设置5个复孔。培养24 h后,分别加入0.0、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0和800.0 mg/L的铁皮石斛提取物,0.5%乙醇培养基溶媒作为空白对照组。进一步培养24 h,避光条件下每孔中加入5% MTT溶液15 μL,并将96孔板在37 ℃、5%CO2下继续培养4 h。随后弃去上清液,向每个孔中加入DMSO液150 μL,避光摇床震摇10 min 以溶解结晶。酶标仪于490 nm波长下测定吸光度值(OD)。细胞活力按公式计算:细胞活力(%)=(OD样品)/(OD空白)×100%。

1.2.4A549细胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量测定 将对数生长期的A549细胞以1×105个/mL密度接种于24孔板,培养24 h后,给与不同浓度的铁皮石斛提取物(100.0 mg/L,200.0 mg/L)继续培养24 h,收集培养基。依据葡萄糖测定试剂盒和乳酸含量检测试剂盒操作说明测定不同组别A549细胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量。

1.2.5铁皮石斛提取物抑制LLC肺癌荷瘤小鼠肿瘤 SPF级雄性C57小鼠适应性喂养1周后,将对数生长期的小鼠肺腺癌LLC细胞用PBS溶液制成细胞浓度为1×107个/mL的细胞悬液,用一次性无菌注射器抽取0.15 mL 细胞悬液接种于C57小鼠右前肢腋窝皮下;待瘤体直径达到100 mm3时随机分组,设置0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶媒模型对照组、铁皮石斛低剂量组(200.0 mg/kg)、铁皮石斛高剂量组(400.0 mg/kg)、CTX阳性对照组(40.0 mg/kg),连续给药14 d,每天1次。实验期间每天密切观察小鼠的精神状态、饮食、活动情况和行为学变化,期间小鼠自由饮食。每天1次称量小鼠体质量和采用游标卡尺测量瘤块最长径a(mm)和最短径b(mm),计算肿瘤体积:V(mm3)=1/2×(a×b2),绘制小鼠体质量变化曲线和肿瘤生长曲线。

1.2.6Western blot检测GLUT4、HK2和PKM2蛋白表达水平 将对数生长的A549细胞以每孔5×105个/mL密度接种在6孔板中,培养24 h后,给与A549细胞不同浓度的铁皮石斛提取物(100.0 mg/L,200.0 mg/L)24 h,用预冷的PBS清洗细胞2次并加入80 μL细胞裂解液,细胞刮刀冰上提取蛋白,12 000 r/min离心取上清,BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。取约50 mg肿瘤组织,剪碎置于离心管中,加入200 μL组织裂解液,匀浆器匀浆至组织完全裂解,冰上裂解10 min,12 000 r/min离心取上清,BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。20 μg总蛋白在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上电泳分离并转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭膜1 h,TBST洗涤3次,每次5 min,以1∶1 000的稀释度依次加入一抗,分别GLUT4、HK2、PKM2,并在4 ℃孵育过夜。然后,在室温下将膜与二抗孵育1 h。最后,滴加增强化学发光试剂(ECL)显色,蛋白质信号使用BIORAD成像系统成像。用GLUT4、HK2和PKM2目的样本条带与内参条带积分光密度比值表示目的蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 A549细胞的增殖

人肺癌A549细胞经不同浓度铁皮石斛提取物处理24 h后,MTT结果显示,铁皮石斛提取物能够明显抑制A549细胞的增殖,且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1。

注:与空白组比较,(1)P<0.01,(2)P<0.001。图1 铁皮石斛提取物对A549细胞增殖的影响Fig.1 Effects of Dendrobium officinale extract on A549 cells proliferation

2.2 A549细胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量

如图2所示,与空白对照组相比,铁皮石斛提取物组的葡萄糖消耗量和乳酸生成量均降低(P<0.05),提示铁皮石斛提取物能够抑制A549肺癌细胞糖酵解,从而发挥抑制肺癌细胞增殖的作用。

注: (1) 与空白组比较,P<0.05;(2)与空白组比较,P<0.01。图2 铁皮石斛提取物对A549细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量的影响Fig.2 Effects of Dendrobium officinale extract on glucose consumption and lactate production in A549 cells

2.3 荷瘤小鼠体质量和瘤体变化

连续给药14 d后,各组肺癌荷瘤小鼠的体质量变化见图3。与模型对照组比较,铁皮石斛提取物给药组LLC肺癌荷瘤小鼠体质量无明显变化,CTX阳性对照组的小鼠体质量急剧降低,表明铁皮石斛提取物具有毒副作用低、安全性高的特点,图4结果显示200.0 mg/kg、400.0 mg/kg的铁皮石斛提取物对LLC肺癌荷瘤小鼠瘤体生长具有明显抑制作用。

注:(1) 与模型组比较,P<0.05。图3 铁皮石斛提取物对荷瘤小鼠体质量影响的变化曲线Fig.3 Changes of body weight of tumor-bearing mice under the effect of Dendrobium officinale extract

注:与模型组比较,(1)P<0.05,(2)P<0.01。图4 铁皮石斛提取物对荷瘤小鼠肿瘤组织体积的影响Fig.4 Changes of lung tumor tissue size of tumor-bearing mice under the effect of Dendrobium officinale extract

2.4 A549细胞与荷瘤小鼠肿瘤组织中GLUT4、HK2和PKM 2蛋白表达

给予100.0 mg/L和200.0 mg/L的铁皮石斛提取物处理A549细胞24 h后,Western blotting 检测结果表明,与空白对照组比较,铁皮石斛提取物呈剂量依赖方式抑制GLUT4和HK2蛋白的表达(P<0.05),但各组细胞中PKM2蛋白表达未发生变化(P>0.05)。见图5。灌胃给予LLC肺癌荷瘤小鼠200.0 mg/kg和400.0 mg/kg铁皮石斛提取物,荷瘤小鼠肿瘤组织中GLUT4和HK2蛋白的表达下调(P<0.05)。见图6。

注:与空白组比较,(1)P<0.05,(2)P<0.01。图5 铁皮石斛提取物对A549细胞中GLUT4、HK2和PKM2蛋白表达水平的影响Fig.5 Effect of Dendrobium officinale extract on the expression level of GLUT4,HK2,and PKM2 protein of A549 cells

注:与模型组比较,(1)P<0.01,(2)P<0.05。图6 铁皮石斛提取物对荷瘤小鼠肿瘤组织中GLUT4、HK2和PKM2蛋白表达水平的影响Fig.6 Effects of Dendrobium officinale extract on the expression level of GLUT4,HK2,and PKM2 protein of tumor tissues in tumor-bearing mice

3 讨论

大多数肿瘤疾病的特征是葡萄糖消耗和乳酸分泌大量增加。在小鼠和人类中的研究已经证实,乳酸被癌细胞再循环利用,由此产生的酸性环境对肿瘤生物学、血管生成、局部侵袭、转移以及抗癌免疫具有广泛的影响,这为癌症的治疗提供了潜在的治疗靶点和策略。铁皮石斛提取物干预A549细胞24 h后,葡萄糖消耗量和乳酸生成量明显降低,提示铁皮石斛提取物影响肺癌细胞能量代谢[16-17]。

非小细胞肺癌的发生发展与葡萄糖转运蛋白和糖酵解限速酶密切相关,尤其是GLUT4、HK2和PKM2,已有研究证实靶向葡萄糖转运蛋白和糖酵解限速酶对人非小细胞肺癌的治疗具有积极作用[18-20]。GLUT4通过自身的构象改变从细胞内膜易位至细胞外膜,即为GLUT 4的转位。肿瘤细胞通过活化或者增加GLUT4 的转位和表达摄取足够的葡萄糖,产生能量来实现其快速增殖,GLUT4是肿瘤糖酵解中的重要蛋白,是非小细胞肺癌治疗中潜在的代谢靶向目标。己糖激酶 (HKs) 是催化葡萄糖代谢限速酶,以4种亚型HK1～HK4存在,HK2在癌症中过度表达,在肿瘤生长、存活和转移中发挥重要作用。丙酮酸激酶(PK)存在4种异构体,包括PKL、PKR、PKM1和PKM2,肿瘤细胞主要依赖PKM2发挥作用。

0.5%乙醇、0.5% CMC-Na被广泛用于细胞实验、动物实验的药物配置和实验过程中,它们作为常用溶媒是非常安全的,对相关实验没有影响。本次预实验也考察核实了两者的良好助溶性和安全性。本实验Western blot法检测铁皮石斛提取物干预A549细胞后,GLUT4和HK2表达呈现下调趋势,PKM2表达无明显变化,表明铁皮石斛提取物通过抑制GLUT4和HK2的表达,从而降低肺癌A549细胞对葡萄糖吸收和乳酸生成,致使肺癌A549细胞能量代谢发生异常。与肺癌荷瘤小鼠模型相比,给予铁皮石斛提取物组的瘤体体积减小,小鼠体质量未见显著降低,铁皮石斛提取物实验组的小鼠肿瘤组织GLUT4和HK2显著下调,PKM2蛋白表达无明显变化,该规律与人A549细胞实验结果一致,表明铁皮石斛提取物能够抑制人肺癌A549细胞增殖、小鼠LLC肺癌荷瘤小鼠体内瘤体生长,其抗肿瘤作用机制可能是调控了肺癌有氧糖酵解的GLUT4和HK2关键蛋白表达。相对于阳性药物,铁皮石斛用药安全性好,具有较好的药物开发前景。