齐墩果酸衍生物DKS26对非酒精性脂肪肝病模型小鼠肝组织Fndc5表达的影响*

韩萧萧,李晨驰,刘冉阳,唐爽,冯琳琳,韩冰,谢汝佳,杨勤,***

(1.贵州医科大学 基础医学院 病理生理学教研室,贵州 贵阳 550025;2.贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室,贵州 贵阳 550025;3.贵州医科大学 医学检验学院 临床微生物免疫教研室,贵州 贵阳 550025)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty live diseaser,NAFLD)是指在没有大量饮酒的情况下、以广泛的肝细胞内脂质显著沉积与持续的肝脏酶异常为特征的一种临床综合征[1],欧美地区NAFLD的发病率在20%以上,我国NAFLD发病率约为15%[2-3]。Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白(type Ⅲ domain-containing protein 5,Fndc5)是由2个纤维蛋白结构域、1个信号肽和1个嵌入细胞膜的C末端疏水结构域构成,其在细胞膜上水解为鸢尾素(irisin)[4]。irisin作为一种新发现的可分泌性代谢调控因子[5],主要在骨骼肌和脂肪组织中表达,少量表达于肾脏、肝脏、胰腺及肺中[6-7]。irisin是促进白色脂肪转变为棕色脂肪的重要调节因子,具有调节细胞脂肪氧化的能力和抑制白色脂肪沉积的作用,还可抑制肝脏糖异生[8]。研究认为,采用腺苷5′-氨酸磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-momophosphate-activated protein kinase,AMPK)激动剂干预敲除Fndc5基因小鼠,发现缺失Fndc5基因小鼠的肝脏脂肪酸氧化功能受损状况得到改善、甘油三脂含量下降,而采用过氧化物酶体增值激活受体ɑ(PPARα)激动剂可上调Fndc5基因缺失小鼠肝脏PPARα靶基因的表达,体外实验亦证实此激动剂抑制棕榈酸诱导的肝细胞脂质沉积[9]。齐墩果酸是一种被临床用于治疗急慢性肝炎的药物,临床应用过程中被发现具有不可避免的毒副作用,国内外学者开始研发齐墩果酸衍生物,到目前为止已有11种的齐墩果酸衍生物问世,DKS26是其中的一种。本实验采用齐墩果酸衍生物DKS26作用于NAFLD模型小鼠,检测小鼠肝脏Fndc5的表达,探究Fndc5是否可以作为NAFLD防治药物的重要靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 4～5周龄C57/BL小鼠40只,体质量18～20 g,购自贵州医科大学实验动物中心,动物使用许可证NO 2000059。

1.1.2主要试剂与仪器 齐墩果酸衍生物DKS26(纯度99%,结构式见图1)由贵州医科大学药学院提供,四氯化碳(纯度99%,100 mL)购自罗恩试剂公司,盐酸二甲双胍(melbine,MET,纯度98%,5 g)购自北京索莱宝生物有限公司,丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和甘油三脂(TG)试剂盒均购自南京建成生物有限公司,Fndc5Ⅰ抗购自Novus Biologicals Europe公司,兔抗β-肌动蛋白(β-actin)购自ABclone公司,油红(Oil red)购自美国Sigma公司。垂直电泳仪购于北京六一生物有限公司,凝胶成像系统购于BIO-BAD公司,全波长酶标仪与高速冷冻离心机购于Thermo公司,冰冻切片机与石蜡切片机购于Leica Biosystems公司。

图1 齐墩果酸衍生物DKS26结构式Fig.1 Chemical structure of oleanolic acid derivative DKS26

1.2 研究方法

1.2.1高脂饮食配方及DKS26配制 普通饲料添加10%猪油、2%胆固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠。DKS26配制:称取DKS26粉末500 mg溶于羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液1 L中,配置成浓度为0.5 g/L的混合溶液。盐酸MET配制:称取盐酸MET粉末500 mg溶于 CMC-Na溶液1 L中,配置成浓度为0.5 g/L的混合溶液。

1.2.2分组与建模 将40只C57/BL小鼠采用随机双盲法分为对照组(CON组)、模型组(MOD组)、MET组与DKS26组,每组10只。按参考文献[10-12]用40%四氯化碳皮下注射加高脂饮食喂养方法建立脂肪肝模型,除CON组外,其余3组小鼠高脂饮食喂养,皮下注射40%四氯化碳植物油、1次/3 d、共4次;共8周建立小鼠NAFLD模型。成模后,正常饮食喂养,MET组和DKS26组小鼠分别给予100 mg/(kg·d)的MET和DKS26灌胃,CON组和MOD组小鼠给予100mg/(kg·d)的CMC-Na灌胃,1次/d,共6周。

1.2.3血清ALT、AST及肝脏TG含量 末次干预后,小鼠禁食禁水12 h,眼球取血1～1.5 mL,室温下静置15 min,以3 000 r/min离心8 min,取血清,采用试剂盒检测小鼠血清ALT、AST;取各小鼠右叶相同部位的肝组织,行TG含量检测。

1.2.4肝组织学观察 末次干预后,小鼠麻醉后处死,无菌条件下剖腹取肝脏,采集各小鼠肝右叶相同部位4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色;另取肝右叶新鲜组织制作冰冻切片,进行油红O染色后在镜下观察。

1.2.5肝组织Fndc5蛋白表达 取小鼠肝组织,加细胞裂解液制备组织匀浆,提取总蛋白、BCA法定量。12%SDA-PEGA蛋白凝胶分离,转膜,脱脂牛奶封闭,加入兔Ⅰ抗[β-actin(1∶5 000)、Fndc5(1∶1 000)]置4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜后加入羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)室温孵育1 h,TBST洗膜,ECL曝光显示特异性条带。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠肝脏中Fndc5蛋白表达

如图2所示,与CON组比较,MOD组Fndc5小鼠肝脏蛋白表达下调(P<0.05),与MOD组比较,MET组与DKS26组小鼠肝脏蛋白表达上调(P<0.05),且DKS26组的Fndc5小鼠肝脏蛋白表达较MET组上调更为明显(P<0.05)。

注:A为Fndc5蛋白条带结果;B为Fndc5蛋白相对表达量结果;(1)与CON组比较,P<0.05;(2)与MOD组比较P<0.05;(3)与MET组比较,P<0.05。图2 小鼠肝脏中Fndc5蛋白表达水平(Western blot)Fig.2 Expression level of Fndc5 protein in mice livers (Western blot)

2.2 小鼠肝脏外观

CON组小鼠肝脏呈现红色,无脂肪变性;MOD组小鼠肝脏相较于CON组体积变大,颜色变黄、质地变硬,肝脏表面黏腻不光滑,呈现脂肪变性;MET组与DKS26组小鼠肝脏与MOD组相比,体积变小、颜色变红、表面光滑、无明显脂肪变性。见图3。

图3 各组小鼠肝脏外观Fig.3 Liver appearance of mice in each group

2.3 小鼠肝组织学变化

HE染色显示MOD组小鼠肝细胞肿胀,胞核移至细胞边缘,部分肝细胞内出现空泡变性及少量炎症细胞;MET组和DKS26组肝小叶结构及肝细胞形态趋于正常,肝细胞轻微肿胀,空泡变性几乎不可见,炎性细胞减少。见图4。

注:红色箭头指示空泡变性。图4 各组小鼠肝细胞结构(HE,×100)Fig.4 Liver cells structure of mice in each group (HE,×100)

2.4 小鼠肝细胞脂质沉积

MOD组肝细胞胞质中出现较多大小不一的橘红色脂滴,MET组和DKS26组肝细胞胞质内橘红色脂滴数量较MOD组明显减少。见图5。

注:红色箭头指示橘红色脂滴。图5 各组小鼠肝细胞脂质沉积(油红O染色,×200)Fig.5 Lipid deposition in liver cells of mice in each group (oil red O staining,×200)

2.5 血清ALT、AST水平及肝脏TG含量

MOD组小鼠血清ALT、AST值明显高于CON组(P<0.01),MET组和DKS26组ALT、AST值明显低于MOD组(P<0.01),且DKS26组AST值明显低于MET组(P<0.01);MOD组小鼠肝组织TG含量较CON组明显增加(P<0.01),MET组和DKS26组小鼠肝组织TG含量较MOD组明显下降(P<0.01),但MET组和DKS26组小鼠肝组织TG含量相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清ALT、AST水平及肝组织TG含量Tab.1 Serum ALT,AST levels and liver tissue TG content in each group of

3 讨论

齐墩果酸是我国科研人员首次从青叶胆植物中提取出的一种五环三萜类化合物,之后发现多种植物与水果中均有齐墩果酸的存在,并已有多项研究证实其具有保肝降脂的作用,可用于NAFLD的治疗[13-16]。但有研究发现,齐墩果酸具有生物利用度低及高剂量会导致肝损伤的缺点[17-18]。因此众多学者为规避其缺点,研发了11种齐墩果酸衍生物[19]。DKS26是贵州医科大学药学院人工合成的一种齐墩果酸衍生物,具有保肝、降糖、抗炎及降脂等作用[20],但是具体降脂的作用机制尚不清楚。本实验通过采用40%四氯化碳橄榄油混合溶液皮下注射加高脂饮食方法建立小鼠NAFLD模型,观察DKS26干预后小鼠脂肪肝的改善情况。

Fndc5的水解产物irisin是一种由小鼠和人类运动诱导的肌肉因子/脂肪因子,它被认为诱导白色脂肪组织棕色化,其主要目的是增加产热和能量消耗。irisin自从被发现以来,就用于多种代谢性疾病的治疗,如肥胖症、2型糖尿病、脂质代谢性和心血管疾病、非酒精性脂肪肝疾病、多囊卵巢综合征和代谢型骨骼疾病等[21]。但它是否作为治疗NAFLD的药物靶点目前尚不明确。有研究表明,irisin具有调节细胞脂肪酸氧化能力和抑制白色脂肪组织沉积的作用[8]。PPARα是调控脂质代谢和脂肪酸氧化的关键转录因子[22],同时也是Fndc5/irisin的下游靶点。AMPK可以上调PPARα基因从而促进脂肪酸氧化。Tateya等[23]发现,敲除Fndc5基因小鼠肝脏正常喂养和禁食诱导的脂肪酸有关基因表达和AMPK活性明显降低,然而AICAR(AMPK激动剂)可改善Fndc5基因缺失造成的肝脏脂肪酸氧化功能受损,并且可降低肝脏TG含量。Liu等[9]也发现,WY14643(PPARα激动剂)可以上调敲除Fndc5基因小鼠肝脏PPARα靶基因的表达,并且体外实验也表明,此激动剂也可以降低棕榈酸诱导的肝细胞脂质沉积[9]。以上皆提示Fndc5对脂肪酸氧化的起着重要的调控作用。因此本实验采用Western blot法检测各组小鼠肝组织Fndc5蛋白的表达,结果显示,MOD组小鼠肝组织Fndc5蛋白表达明显少于CON组,MET组与DKS26组小鼠肝组织Fndc5蛋白表达较MOD组上调,提示DKS26与MET可能通过调控Fndc5的蛋白表达来改善小鼠NAFLD。

各组小鼠取肝脏外观上:MOD组小鼠肝脏颜色变黄、体积变大、脂肪变性,而CON组肝脏颜色为红色、表面光滑、无脂肪变性,与MOD相比,MET组和DKS26组小鼠肝脏颜色变红、体积变小。HE染色结果显示CON组小鼠肝细胞结构正常、肝小叶排列整齐,MOD组小鼠肝细胞表现为空泡样变性、汇管区炎性细胞浸润、肝小叶结构紊乱,MET组与DKS26组相比于MOD组肝细胞空泡变性减轻、汇管区炎性细胞浸润减轻、肝小叶结构接近正常。油红O染色结果显示CON组小鼠肝细胞未见明显脂质沉积,MOD组小鼠肝细胞内可见明显红色脂滴颗粒,相较于MOD组,MET组和DKS26组小鼠肝细胞内红色脂滴数目减少。小鼠肝组织TG含量结果提示:MOD与CON组相比明显上升,MET组与DKS26组小鼠相较于MOD组小鼠明显下降。而且,MET组与DKS26组干预处理后小鼠血清ALT、AST水平相较于MOD组明显减少。以上结果均提示DKS26治疗之后NAFLD小鼠的肝组织学形态、功能指标及肝脂肪沉积均有所改善。

综上所述,齐墩果酸衍生物DKS26具有护肝作用,其机制之一可能是通过irisin前体Fndc5这一靶点来调控脂质氧化分解的。