燃煤氟对雌性大鼠下丘脑、垂体、卵巢脏器系数及组织TGF-β1表达的影响*

黄燕子,喻茂娟,柳青

(1.贵州医科大学 公共卫生学院,贵州 贵阳 550004;2.贵阳市云岩区疾病预防控制中心 疾控科,贵州 贵阳 550004;3.南通市卫生健康委员会 疾病预防控制处,江苏 南通 226000)

地方性燃煤型氟中毒(简称燃煤型氟中毒)是由于居民使用高氟煤污染环境介质或食物引起的以氟斑牙和氟骨症为主要特征的一种慢性全身性疾病[1]。在燃煤氟中毒的机制研究中,最早且较多属骨相方面的损害,随着对氟中毒研究的深入,近年来研究热点逐渐转向非骨相改变,尤其是生殖系统方面[2-3]。转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)属于一类细胞调节因子,在女性生殖系统疾病中,TGF-β1有重要调节作用[4-6],动物实验发现,TGF-β1不仅能调控卵巢中卵泡的发育,而且在机体免疫-神经-内分泌网络中起到了关键作用[7-8],提示TGF-β1与生殖关系密切。本研究模拟病区女性持续氟暴露情况,建立雌鼠燃煤型氟中毒模型,通过检测雌鼠下丘脑-垂体-卵巢中TGF-β1表达情况,探讨氟对雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢功能轴的影响及其可能机制,进一步为防治燃煤氟所致女性生殖系统损害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 健康的清洁级雌性SD大鼠120只,由贵州医科大学实验中心提供,鼠龄28 d,体质量60～80 g,研究获学校伦理委员会批准(编号1603185)。

1.1.2主要仪器与试剂 Nikon TE2000-U倒置显微镜(日本尼康公司),Leica RM2135型切片机(德国Leica公司)。氟化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司),TGF-β1、一抗体、二抗、DAB显色剂(天津市科密欧化工有限公司)。

1.2 研究方法

SD大鼠适应性喂养1周后,参考文献[9-10]测定饲料中氟元素含量为(10.38±0.41)mg/kg、自来水氟元素浓度为(0.83±0.01)mg/L,均符合非氟中毒地区食物和饮用水标准。大鼠按体质量从小到大排列,采用随机数字表法随机分为对照组、低氟组、中氟组和高氟组,每组30只,对照组大鼠给予正常饲料,低、中、高氟组分别用25、50、100 mg/kg的含氟饲料喂养[11-13]。

1.3 检测指标

1.3.1尿氟检测 染氟第3、4、5个月时,将待处理的10只SD大鼠放入代谢笼中收集其24 h尿液,采用氟离子选择电极法测定尿氟离子浓度,参照标准为《尿中氟的离子选择电极测定方法》(WS/T30-1996)。

1.3.2骨氟检测 染氟第3、4、5个月时,每组分别处死10只SD大鼠,取其左下肢骨于马弗炉内灰化,采用氟离子选择电极法测定骨氟离子浓度,参照标准为《氟离子选择电极测定法》(WS/T89-1996)。

1.3.3氟斑牙判定 染氟第5个月时,判定SD大鼠氟斑牙情况[14-15](正常,牙釉质呈半透明、橘黄色或棕黄色,色泽度好;轻度,牙釉质出现微小规模的棕白相间横纹;中度,牙釉质白色横纹变宽甚至不规则;重度,牙釉质棕色横纹消失、大部分牙表面呈白粉笔样)。

1.3.4下丘脑、垂体及卵巢组织脏器系数 染氟第3、4、5个月时,每组分别处死10只SD大鼠,分离下丘脑、垂体及卵巢,称重计算脏器系数,脏器系数=组织的脏器质量/大鼠体质量。

1.3.5下丘脑、垂体及卵巢组织的TGF-β1表达 染氟第3、4、5个月时,各组分别处死10只SD大鼠,分离下丘脑、垂体及卵巢,用10 %中性甲醛溶液固定24 h、脱水、浸蜡及切片,免疫组化法测定下丘脑、垂体及卵巢组织中TGF-β1的表达情况,同时采用半定量法进行分析,以目标区域染色深浅和面积大小确定靶蛋白的量,染色区域颜色越深说明所测蛋白的量越多。

1.4 统计学分析

应用SPSS 11.5软件进行数据处理与分析,符合正态分布且方差齐的计量资料,用单因素方差分析进行比较,不同组别之间采用SNK法进行两两比较;计数资料采用卡方检验,计数资料两两比较采用Bonferroni法;双向有序资料采用线性趋势检验;检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠尿氟含量

随着喂养时间延长,4组大鼠尿氟含量增加,对照组大鼠3个时间点尿氟比较、差异无统计学意义(P>0.05),而3个染氟组大鼠尿氟含量组内比较、差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,除低氟组染氟3、4月大鼠尿氟含量无明显升高外,其余各染氟组及染氟时间点大鼠的尿氟含量明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时点的尿氟浓度Tab.1 Contents of urinary fluoride of each group in different

2.2 大鼠骨氟含量

随着喂养时间延长,4组大鼠骨氟含量增加,对照组大鼠3个时间点骨氟比较、差异无统计学意义(P>0.05),而3个染氟组大鼠骨氟含量组内比较、差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,除低氟组染氟3月大鼠骨氟含量差异无统计学意义(P>0.05),其余各染氟组及染氟时间点大鼠的骨氟含量明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠不同时点骨氟浓度Tab.2 Contents of bone fluoride of each group in different

2.3 大鼠氟斑牙

2.4 大鼠下丘脑、垂体及卵巢组织脏器系数

染氟第3个月时,各染氟组雌性大鼠下丘脑、垂体组织脏器系数比较,差异均无统计学意义(P>0.05) 。染氟第4、5个月时,各染氟组雌性大鼠卵巢组织脏器系数比较,差异有统计学意义(P<0.05),中氟组和高氟组卵巢组织脏器系数高于同时间点的对照组(P<0.05),且高氟组雌性大鼠卵巢组织脏器系数随染氟时间呈上升趋势(P<0.05)。见表4～表6。

表3 染氟第5个月时SD大鼠的氟斑牙情况(n=10)Tab.3 Degrees of dental fluorosis of rats in 5 months(n=10)

表4 各组大鼠不同时点下丘脑脏器系数Tab.4 Changes of hypothalamus organ coefficient of each group in different

表5 各组大鼠不同时点垂体脏器系数Tab.5 Changes of pituitary organ coefficients of each group in different

表6 各组大鼠不同时点卵巢脏器系数Tab.6 Changes of the right ovarian organ coefficients of each group in different

2.5 下丘脑、垂体及卵巢组织TGF-β1的表达

2.5.1下丘脑中TGF-β1的表达 染氟第5个月时,各染氟组下丘脑组织TGF-β1表达比较,差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比较,各染氟组中TGF-β1表达差异均有统计学意义(P<0.05),并随染氟剂量增加有上升趋势,但同一染氟组TGF-β1表达水平随染氟时间先降后升(P<0.05)。见表7、图1。

表7 各组大鼠不同时点下丘脑中TGF-β1的表达Tab.7 Expression of TGF-β1 in hypothalamusin of each group in different

注:棕色为TGF-β1表达阳性。图1 各组大鼠不同时点下丘脑组织中TGF-β1表达(HE,×400)Fig.1 Expression of TGF-β1 in hypothalamusin of each group in different periods(HE,×400)

2.5.2垂体中TGF-β1的表达 染氟4、5个月时,各染氟组大鼠垂体组织TGF-β1表达水平比较,差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,各染氟组大鼠染氟4个月时,垂体组织TGF-β1表达水平均低于对照组(P<0.05),而在第5个月,中、高氟组大鼠垂体组织TGF-β1表达水平低于对照组和低氟组(P<0.05)。见表8、图2。

表8 各组大鼠不同时点垂体中TGF-β1表达Tab.8 Expression of TGF-β1 in pituitary of each group in different periods

注:棕色为TGF-β1表达阳性。图2 各组大鼠不同时点垂体组织中TGF-β1表达(HE,×400)Fig.2 Expression of TGF-β1 in pituitary of each group in different periods(HE,×400)

2.5.3卵巢中TGF-β1的表达 3个时间点各染毒组卵巢组织中TGF-β1表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,除第4个月低氟组大鼠卵巢组织中TGF-β1表达水平无统计学差异(P>0.05)、其余各组染氟及染氟时间点大鼠卵巢组织中TGF-β1表达水平均低于对照组,且低、中氟组随染氟时间延长而降低(P<0.05)。见表9、图3。

3 讨论

本研究结果显示,与对照组相比,不同氟剂量组均出现了不同程度的氟斑牙,且检出率随染毒剂量而增加,这与相关报道氟斑牙是氟中毒早期最常见的症状结果一致[16-17];同时,尿氟和骨氟作为机体代谢综合作用结果,可反映近期氟的摄入量和体内的蓄积情况[18],本实验中染毒组的尿氟、骨氟受剂量和时间影响,呈上升趋势,说明雌性大鼠通过食物染氟方式导致氟在体内逐渐被代谢和蓄积结果。

表9 各组大鼠不同时点卵巢中TGF-β1的表达Tab.9 Expression of TGF-β1 in ovarian of each group in different

注:棕色为TGF-β1表达阳性。图3 各组大鼠不同时点卵巢组织中TGF-β1表达(HE,×400)Fig.3 Expression of TGF-β1 in ovarian of each group in different periods(HE,×400)

在有关研究化学毒物对实质脏器的影响中,脏器系数能够反映化学毒物对脏器的影响 ,也是寻找毒物作用靶器官的重要线索[19];脏器系数下降有可能是该实质器官发生萎缩、退行性改变;脏器系数升高 ,可考虑实质器官有充血、水肿、增生及肥大等变化的可能性。在本研究中,各染毒组雌性大鼠下丘脑、垂体组织脏器系数于各染毒时间段差异无统计学意义(P>0.05),但卵巢脏器系数于染毒第4个月、第5个月差异具有统计学意义(P<0.05),且中氟组、高氟组卵巢组织脏器系数高于对照组(P<0.05);这表明氟中毒可能对下丘脑、垂体脏器系数未产生明显的影响,这与有关研究探索氟中毒对生殖系统影响结果相似[20-21];以上研究结果可能与所摄入氟通过血脑屏障含量有关,而且以往研究已经证实氟主要的蓄积部位是骨骼[22-23],因此氟可能进入其他靶器官的含量相比骨骼较少;并且已有研究表明,机体过多氟可通过血脑屏障蓄积在脑组织,从而诱发脂质过氧化导致脑细胞结构破坏[24]。因此出现以上结果有可能与血脑屏障特异性主动转运有关,并且脑脊液的引流排泄作用也有可能将脑内多余的氟排出,从而维持脑内动态平衡[25]。故本研究中氟到达脑组织的量不会随氟摄入量而增加,少量蓄积在脑内的氟对脑组织主要作用部位可能是大脑皮层,对接近间脑位置的下丘脑和位于垂体窝的垂体仅产生轻度的毒性作用,还不足以导致下丘脑、垂体出现显的病理学改变;以上与周勇江[21]通过大鼠氟化钠饮水方式染毒结果相似,说明慢性氟中毒主要影响雌性大鼠的卵巢组织,而对下丘脑和垂体组织影响不明显。

TGF-β家族成员包括TGF-β1至TGF-β6,但在哺乳动物中仅发现TGF-β1至TGF-β3,其中,以TGF-β1的活性最强,数量最多,几乎存在于所有细胞中。有关氟中毒非骨相研究中,韩学卫[26]发现氟作用下大鼠肾脏TGF-β1 表达显著升高,TGF-β1可作为氟作用下肾脏损害主要检测指标之一。在本研究中,不同染毒组下丘脑组织TGF-β1表达水平仅于第5个月差异具有统计学意义(P<0.05),并随染毒剂量而增加,说明氟在持续染毒情况下才可刺激下丘脑组织中TGF-β1表达增强,以上与韩学卫得到结果相似。但在雌鼠垂体中TGF-β1表达中,我们观察到染毒第4个月、第5个月,中氟组、高氟组雌鼠垂体中TGF-β1表达随染毒时间呈低表达水平,且较对照组下降幅度大,在有关氟中毒研究结果提示对照组中出现了研究部位TGF-β1微表达[26],说明长时间氟暴露情况下氟对垂体组织中小分子活性物质表达的影响程度较正常情况下大。同时,有研究认为[27]TGF-β1能够在卵巢组织中高度表达,参与卵泡发育、颗粒细胞的增殖、分化和排卵过程,本研究也观察到TGF-β1在雌鼠卵巢中表达,但受氟剂量的影响呈低表达水平;有关研究提到:许多细胞因子既可影响下丘脑-垂体-卵巢轴激素的分泌,同时这些细胞因子的产生又可被这些激素调节[28];本研究中出现氟作用下雌鼠下丘脑、垂体、卵巢脏器中TGF-β1表达趋势不同,这有可能与下丘脑-垂体-卵巢性腺轴双向调节功能有关。同时,本研究中未观察到下丘脑-垂体组织脏器系数有明显影响,但出现了下丘脑-垂体TGF-β1表达异常,有可能是氟导致该部位组织中小分子活性因子出现异常,但尚未引起该部位组织形态及生理功能出现明显变化。因此,本研究提示,氟作用于雌性大鼠后可影响下丘脑-垂体-卵巢性腺TGF-β1表达水平,且主要作用部位是卵巢组织。