电针调控lncRNA NEAT1减轻类风湿关节炎滑膜成纤维细胞炎症反应的研究

黄志强 涂海水 李莹莹 郑志煌 李佳璇 程镇达 苏稼夫

【摘 要】目的：观察电针对调控lncRNA NEAT1减轻类风湿关节炎大鼠滑膜成纤维细胞炎症反应的影响。方法：将16只2月龄大鼠应用随机数字表法分为空白对照组和电针组，每组8只。空白对照组大鼠未接受干预，电针组大鼠予以电针干预，分别制备空白对照组、电针组血清。予以连续酶消化法獲取3周龄SD大鼠滑膜成纤维细胞，波形蛋白免疫组化染色进行鉴定；再将6孔板中已培养的滑膜成纤维细胞随机分为空白对照组、模型对照组、电针组成纤维细胞。空白对照组成纤维细胞予以空白对照组血清干预，模型对照组成纤维细胞予以含10 ng·mL-1 白细胞介素-1β（IL-1β）的空白对照组血清诱导滑膜成纤维细胞致炎，电针组成纤维细胞予以含10 ng·mL-1 IL-1β的电针组血清干预。Real-time PCR检测各组滑膜成纤维细胞中lncRNA NEAT1水平变化；Western blot检测各组滑膜成纤维细胞基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白表达含量。结果：经波形蛋白免疫组化染色后，大鼠滑膜成纤维细胞波形蛋白染色为阳性，证实成纤维细胞提取成功。与空白对照组比较，模型对照组中lncRNA NEAT1的相对表达水平显著升高（P < 0.05）；与模型对照组比较，电针组中lncRNA NEAT1相对表达水平显著降低（P < 0.05）。Western blot结果显示，与模型对照组比较，电针组MMP-3、RELA、TNF-α蛋白表达含量显著降低（P < 0.05）。结论：电针可通过调控lncRNA NEAT1减轻类风湿关节炎大鼠滑膜成纤维细胞炎症反应。

【关键词】 类风湿关节炎；滑膜成纤维细胞；炎症反应；电针；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of electroacupuncture on reducing the inflammatory response of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis rats by regulating lncRNA NEAT1.Methods：Sixteen 2-month-old rats were randomly divided into a blank control group and an electroacupuncture group using a random number table method，with 8 rats in each group.Rats in the blank control group were not given intervention，while those in the electroacupuncture group were given electroacupuncture intervention，and serum from the two groups was prepared separately.The synovial fibroblasts of 3-week-old SD rats were obtained by continuous enzymatic digestion，and identified by vimentin immunohistochemical staining.Then，the cultured synovial fibroblasts in the 6-well plate were randomly divided into a blank control group，a model control group，and an electroacupuncture group.The blank control group was intervened with serum from the blank control group，while the model control group was induced inflammation by serum with 10 ng·mL-1 interleukin-1β（IL-1β）from the blank control group，and the electroacupuncture was intervened by serum containing 10 ng·mL-1 IL-1β from the electroacupuncture group.Real-time PCR was used to detect the level changes of lncRNA NEAT1 in synovial fibroblasts of each group.Western blot was used to detect protein expression contents of MMP-3，RELA and TNF-α.Results：After vimentin immunohistochemical staining，the rat synovial fibroblasts were positive for vimentin staining，which confirmed the successful extraction of fibroblasts.Compared with the blank control group，the relative expression level of lncRNA NEAT1 in the model control group was significantly increased（P < 0.05）.Compared with the model control group，the relative expression level of lncRNA NEAT1 in the electroacupuncture group was significantly reduced（P < 0.05）.Western blot results showed that compared with the model control group，the protein expression contents of MMP-3，RELA，and TNF-α in the electroacupuncture group significantly decreased（P < 0.05）.Conclusion：Electroacupuncture can alleviate the inflammatory response of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis rats by regulating lncRNA NEAT1.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;synovial fibroblasts;inflammatory response;electroacupuncture;rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以受累关节滑膜炎症、软骨及骨组织破坏为主要病理特点的慢性自身免疫性关节疾病［1］。临床多见关节晨僵、反复疼痛，严重者可见关节功能障碍、残疾等，危害正常生活［2-3］。研究证实，电针治疗RA具有良效，可有效缓解临床症状，改善疾病活动度［4-5］。本实验拟观察电针干预大鼠足三里一定时间后获得的血清（电针后血清）对白细胞介素-1β（IL-1β）诱导的体外大鼠滑膜成纤维炎症细胞模型lncRNA核富集转录本1（NEAT1）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、V-Rel网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的影响，以期阐明电针防治RA的部分作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康雄性2月龄SD大鼠（SPF级）16只，体质量200～230 g，用于制备血清；雄性健康3周龄SD大鼠（SPF级）5只，体质量60～80 g，用于提取滑膜成纤维细胞。以上动物购于斯莱克（上海）实验动物有限责任公司，动物生产许可证号SCXK（沪）2012-0002；饲养于福建中医药大学实验动物中心，动物使用许可证号SYXK（闽）2019-0001；动物处置操作遵照科技部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 主要仪器 华佗牌SD-Ⅱ型电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；无菌操作台（型号AIRTECH，苏州安泰）；CO2恒温培养箱（型号BB16/BB5060，德国Heraus）；DNA扩增仪（型号9600，美国PE公司）；凝胶成像系统（型号GELDOC2000，美国BIO-RAD）。

1.3 主要试剂 RELA抗体、TNF-α抗体、波形蛋白抗体（型号10748-1-AP、17590-1-AP、10366-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；MMP-3抗体（型号bs-0413R，博士德生物工程有限公司）；GAPDH（型号21612，美国Signalway Antibody有限公司）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；lncRNA NEAT1（正向TGG CTA GCT CAG GGC TTC AG，反向TCT CCT TGC CAA GCT TCC TTC）；GAPDH（正向ACG GCA AGT TCA ACG GCA CAG，反向GAA GAC GCC AGT AGA CTC CAC GAC）引物（福州尚亚生物技术有限公司）等。

2 实验方法

2.1 血清制备 将16只2月龄SD雄性大鼠按照随机数字表法分为空白对照组和电针组，每组8只。空白对照组大鼠予以常规饲养，未进行干预；电针组大鼠予以电针刺激（取穴双侧足三里）［6］，每次30 min，每日1次，连续干预7 d［7］。干预完成后，将麻醉状态（2 %戊巴比妥钠）下的大鼠予以腹主动脉采血，经离心获取空白对照组、电针组血清，经水浴灭活（56 ℃）及过滤除菌后，-20 ℃保存，细胞实验时用DMEM配制为10%浓度进行干预。

2.2 滑膜成纤维细胞的培养、鉴定与干预 将麻醉状态（2%戊巴比妥钠）下的3周龄SD大鼠人工脱颈处死，在洁净环境下分离大鼠双侧膝关节滑膜组织，并予以Hanks液洗净，后将滑膜组织剪碎，施以连续胰蛋白酶（0.25 %）消化法進行成纤维细胞分离、培养，倒置显微镜、波形蛋白鼠免疫组化染色鉴别［8］。

2.3 滑膜成纤维细胞致炎模型的复制 以无菌培养瓶为载体孵育大鼠滑膜成纤维细胞，设置孵育条件（37 ?C、5%CO2），每隔24 h更换1次培养液，镜下观察滑膜成纤维细胞状态较佳，视野干净，培养液无浑浊，待细胞长至90%的空间时，经10 ng·mL-1的IL-1β干预滑膜成纤维细胞12 h后复制炎症模型［9］。

2.4 滑膜成纤维细胞的干预 将6孔板中培养状态良好的第2代滑膜成纤维细胞随机分为空白对照组、模型对照组、电针组。空白对照组：正常滑膜细胞 + 空白对照组血清干预。模型对照组：IL-1β诱导滑膜细胞+空白对照组血清干预。电针组：IL-1β诱导滑膜细胞+电针组血清干预。

2.5 Real-time PCR检测滑膜成纤维细胞中lncRNA NEAT1相对表达水平 采用Trizol法提取各组滑膜成纤维细胞中的总RNA，进行反转录，取1 μg总RNA反转录成cDNA，反转录条件：55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。以1 μL cDNA为模板扩增lncRNA NEAT1。扩增反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。待上机检测后分析各组lncRNA NEAT1相对表达水平。

2.6 Western blot检测滑膜成纤维细胞中MMP-3、

RELA和TNF-α蛋白表达 提取各组干预后的滑膜成纤维细胞总蛋白，进行蛋白定量分析（BCA法），待完成配制分离胶（12%）与浓缩胶（5%）后，插入梳子塑形制备上样孔，然后进行上样（每孔20 μg），再经电泳、转膜（25 V电压、1.3 A电流）、封闭、杂交、ECL显影、图像分析。

2.7 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 大鼠膝关节滑膜成纤维细胞镜下鉴定 经波形蛋白免疫组化染色后，大鼠膝关节滑膜组织成纤维细胞波形蛋白染色（棕黄色）为阳性组，阴性对照组未染色。见图1。

3.2 3组大鼠滑膜成纤维细胞中lncRNA NEAT1水平变化 Real-time PCR结果显示，模型对照组lncRNA NEAT1水平较空白对照组显著升高（P < 0.05），而电针组lncRNA NEAT1水平较模型对照组降低（P < 0.05）。见表1。

3.3 3组大鼠滑膜成纤维细胞中MMP-3、RELA和TNF-α蛋白表达比较 Western blot结果显示，与空白对照组比较，模型对照组MMP-3、RELA和TNF-α蛋白表达升高（P < 0.05）；与模型对照组比较，电针组MMP-3、RELA和TNF-α蛋白表达较低（P < 0.05）。见图2、表2。

4 讨 论

RA属中医学“痹证”范畴，其发病多为禀赋不足、营卫不和所致。足三里是足阳明胃经的合穴。研究证实，电针足三里具有扶正益气血，通络止痹痛之效，可有效抑制RA的病情发展［10］。长链非编码RNA（lncRNA）在RA发生、发展中的重要作用已得到重视，其中lncRNA NEAT1与RA的发生、发展密切相关［11］。本实验结果显示，IL-1β刺激下的大鼠滑膜成纤维细胞中lncRNA NEAT1水平显著升高，这与RA患者lncRNA NEAT1升高结果相一致［12］。RELA在NF-κB的经典途径中发挥核心作用，可促进关节的炎症和破坏［13］。此外，RELA可通过多种机制激活IL-1β刺激下的MMPs活化［14］。MMP-3作为MMPs家族中重要组成之一，归属于基质溶解素家族，在RA病理进程中，受炎症因子的刺激，滑膜成纤维细胞及软骨细胞可大量分泌MMP-3，MMP-3不仅可直接促进RA血管翳的形成，降解骨组织（软骨和骨质），还可活化并协同其他MMPs进一步加重RA病情［15］。TNF-α是RA病理生理学中紊乱过程的重要炎症介质，可促进炎症以及关节软骨基质的退化［16］。在炎症过程中，TNF-α作为主要细胞因子，刺激IL-6的释放，使软骨细胞释放分解代谢蛋白酶，从而进一步诱导MMPs的释放［17-18］。

本实验结果显示，IL-1β刺激下的大鼠滑膜成纤维细胞经电针干预后，可显著下调lncRNA NEAT1水平，并降低致炎滑膜成纤维细胞中RELA、MMP-3及TNF-α蛋白含量表达。表明大鼠电针能有效抑制IL-1β诱导的大鼠滑膜成纤维细胞炎症反应，其机制可能与下调lncRNA NEAT1水平及相关炎症指标表达有关，为临床电针治疗RA提供实验支持。此外，lncRNA NEAT1与炎症因子之间的深层次调控关系，以及是否与关联的miRNA存在竞争性调控关系仍需要今后进一步探讨。

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收稿日期：2022-12-13；修回日期：2023-01-19

基金项目：福建省科技厅自然科学基金项目（2019J01363）；福建省名老中医药专家苏稼夫传承工作室建设项目（闽卫办中医发〔2018〕216号）；福建省中医学术流派泉州留氏针灸传承工作室建设项目（闽卫中医〔2018〕52号）

作者单位：1.泉州市中医院，福建 泉州 362000；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；3.福建中医药大学，福建 福州 350022

通信作者：黄志强