基于Hedgehog信号通路探讨补肾中药靶向治疗骨质疏松症的机制研究进展

2023-05-17杨军邓强李军杰乔小万

风湿病与关节炎 2023年4期

杨军邓强李军杰乔小万

【摘要】中医学将骨质疏松症归于“骨痹”“骨痿”等范畴，并认为肾精不足、骨髓生化乏源、骨骼失养是“骨痿”等疾病的主要病机。近年来，随着现代分子生物学的发展，对骨代谢信号通路和相关作用靶点基因的认识不断深入，研究发现Hedgehog信号通路在骨骼发育中发挥着关键作用，其传导异常可导致骨质疏松症等骨代谢疾病的发生。以Hedgehog信号通路在骨质疏松症发病过程中的作用机制为基础，探讨经典补肾中药及中药复方通过此通路治疗骨质疏松的具体机制，从而为具有补肾功效的单味中药及复方临床应用提供基础研究支撑，为今后相关中药的研发提供参考。

【关键词】骨质疏松症；Hedgehog信号通路；补肾中药；机制；研究进展；综述

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是多种病因共同作用于人体导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折为特征的全身性骨代谢性疾病，已成为全球患病率、致残率最高，治疗费用最昂贵的疾病之一，严重威胁中老年男性、绝经后妇女、部分青少年等群体骨骼健康［1-2］。流行病学研究显示，我国年龄 > 50岁人群OP患病率为19.2%，年龄 > 65岁人群患病率为32.0%［3］。我国低骨量人群数量巨大，年龄 > 50岁的人群低骨量率高达46.4%，是未来患OP的高危人群［4-5］。OP在中老年骨病中居首位［6］，造成的骨折严重影响患者生活质量及老年人寿命，医疗承受了巨大负担。

中医学将OP归属于“骨痹”“骨痿”等范畴，中医理论认为“肾为先天之本”“肾生骨髓”“五藏所主，……肾主骨”“其充在骨”，骨骼的生长发育、强劲、衰弱与肾精盛衰关系密切，肾精充足则骨髓生化有源，骨骼得以滋养而强健有力；肾精亏虚则骨髓生化乏源，骨骼失养而萎弱无力。《灵枢·经脉》指出：“足少阴气绝则骨枯……骨不濡则肉不能著也，骨肉不相亲则肉软却发无泽者骨先死。”指出肾虚是引起骨痿的主要病机，说明几千年前中医学就确立了“肾主骨”的指导思想，建立了“肾-精-髓-骨”骨骼内在化生体系，即肾精对骨的充实与濡养发挥着重要作用，主导着骨的生长发育、生理功能的发挥，是人体骨代谢的内环境［7-9］，从而为补肾填精法治疗OP提供了最基本的理论依据。近年来临床以骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和膳食补充剂等西药治疗为主，在缓解或消除疼痛、改善骨代谢的同时，具有胃肠道不良反应多、治療费用高昂等缺点。而中医药在慢性代谢性疾病的临床应用中缓解了西药诸多不良反应，且价格低廉，临床效果良好［10］。Hedgehog信号通路在骨代谢过程中起重要调控作用，近年在骨科研究中备受关注。该通路主要对骨形成和骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨进行调控［11］。本文在查阅大量国内外文献后就补肾中药基于Hedgehog信号通路靶向治疗OP的机制研究作一综述，以期为治疗OP的中药研发及临床诊疗提供参考。

1 OP与Hedgehog通路

破骨细胞与成骨细胞的稳态失衡，骨代谢紊乱，从而导致OP［12］。治疗上主要为抑制骨吸收、促进骨形成及膳食补充等手段，达到缓解或消除疼痛，增加骨密度，进而降低骨折的风险。Hedgehog信号通路调控成骨细胞的分化增殖，提升骨量，达到防治OP的作用。Hedgehog通路由Hedgehog蛋白、Gli蛋白、Ptched（Ptc）、Smoothened（Smo）抗体以及下游靶基因组成［13］。Hedgehog信号通路是通过Hedgehog蛋白促进成骨细胞的骨形成功能，达到骨形成与骨吸收之间的平衡。Gli蛋白在脊椎动物骨骼中主要有Gli1、Gli2和Gli3三型（Gli1和Gli2蛋白主要为激活下游靶基因而活化Hedgehog通路，Gli3为抑制因子，可阻碍通路传导）。首先，当该通路Hedgehog蛋白匮乏时，Ptc直接与Smo联结，使其活性降低，并抑制下游靶基因的转录过程。若Hedgehog蛋白表达正常则与Ptc结合，消除Ptc对Smo活性的抑制作用，从而促进Gli1蛋白激活下游靶基因的转录，促进成骨细胞增殖，从而促进受损骨组织的修复［14］，达到抗OP的作用。其次，Runx2和Osx是骨形成过程中的重要转录因子，其表达过程多个阶段中都受到Hedgehog蛋白影响，并可以促进BMSCs向成骨分化增殖（BMSCs主要依靠Runx2因子向成骨前体细胞分化，进一步促进Osx因子分化为成熟的成骨细胞）［15］。最后，PPARγ是促进BMSCs成脂分化的关键转录因子，同时也能负反馈于Runx2，而抑制骨形成［16-17］。C/EBPα也可以在PPARγ的辅助下用来评估BMSCs成脂分化情况［18］。骨代谢过程中涉及到众多生长因子，骨吸收和骨形成过程在不断地进行，不同生长因子在不同阶段的成骨过程中发挥着不同作用，在促进成骨细胞增殖、成骨及骨吸收等方面作用显著。然而，目前Hedgehog信号通路在OP中的作用机制尚未完全明确，仍然需要继续探究，进一步挖掘补肾中药基于Hedgehog信号通路靶向治疗OP等骨代谢疾病的潜力。

2 中药调控Hedgehog通路治疗OP的研究

2.1 单味中药近年对于中药有效成分的研究进展迅猛，已进入分子水平。补肾中药的有效成分能调节骨吸收与骨形成的平衡，使骨形成大于骨吸收，而延缓或防止OP的发生。

2.1.1 杜仲杜仲在我国已有超过两千年的应用历史，并出现于众多经典方剂。《神农本草经》记载：“主腰脊痛，益精气，强筋骨。”《日华子本草》中记载杜仲具有“治肾劳，腰脊挛”的作用。现代药理研究表明，杜仲提取物中主要的活性物质有木质素类和环烯醚萜类，其水、醇提物和药物血清能促进成骨细胞增殖分化，促进骨重建，改善骨代谢紊乱，防止OP的发生［19］。碱性磷酸酶、骨钙素、骨保护素及Ⅰ型前胶原C-端前肽/N-端前肽为骨形成的标识，对成骨细胞的活性有很好的反映作用［20］。HA等［21］通过杜仲皮活性成分干预小鼠骨髓细胞来研究其对成骨细胞的增殖作用及对破骨细胞的抑制作用，发现其部分提取物甲醇提取物、三氯甲烷等可诱导释放生长激素，从而促进成骨细胞的增殖，少数成分对破骨细胞有抑制作用，由此促进骨重建。研究发现，杜仲通过影响PTH、RUNX2、PPAR等因子的表达调控BMSCs分化，促进骨稳态的平衡，治疗OP［22］。其中，Runx2属于Runt基因家族中的重要转录因子，联结成骨细胞后可以激活骨钙蛋白、骨桥素等影响成骨细胞分化和骨重建，骨代谢达到最佳平衡状态［23］。Hedgehog通路中多个阶段有Runx2的参与，并且其蛋白的表达在各阶段受Hedgehog蛋白影响。

2.1.2 补骨脂补骨脂作为补肾壮阳类中藥广泛应用于骨科临床实践中。《药性论》记载补骨脂有补肾壮阳强骨的功效。《方外奇方》云：“……元阳坚固，骨髓充实，涩以治脱。”现代药理学研究发现，该药主要活性成分为类黄酮、香豆素及萜类酚类化合物［24］。补骨脂素是香豆素中活性成分，韩宇等［25］通过给大鼠灌服补骨脂素制剂，配制含药血清并用之干预大鼠BMSCs，用酶联免疫吸附法检测大鼠BMSCs中碱性磷酸酶蛋白含量，实时定量PCR法检测Shh、Ptch1、Gli1 mRNA及蛋白表达。结果发现，补骨脂素能减弱Ptch1 mRNA及蛋白表达，提升Shh、Gli1 mRNA及蛋白的表达。Ptch1属于Ptc，是Hedgehog通路转录过程中的重要因子，Shh是通路中关键启动蛋白。Gli1刺激下游转录基因而活化Hedgehog通路，使大鼠BMSCs向成骨分化，为转录过程中的激化因子。Ptch1与Shh结合消除了Ptc对Smo活性的抑制，诱导下游转录基因的表达，使Hedgehog通路正常发挥作用，以调控骨密度。Shh促进骨矿化，促进碱性磷酸酶活性及表达，也可诱导Gli1表达而增强成骨细胞增殖。补骨脂能通过调控Hedgehog通路中Shh、Ptch1、Gli1 mRNA及蛋白的表达促进BMSCs成骨分化，维持骨代谢平衡，提高骨密度，防治OP。

2.1.3 淫羊藿淫羊藿很早被广泛应用于治疗OP的复方中，近年来对其作用机制的研究越来越深入。《玉楸药解》记载味辛、苦，微温，入肝、肾经，有荣筋强骨之功。《本草备要》言：“补命门，益精气，坚筋骨。”该药活性成分主要为淫羊藿总黄酮（TFE），TFE通过多种信号通路促进成骨细胞分化，从而在OP的治疗中发挥作用［26］。Hedgehog蛋白在多个阶段影响Runx2和Osx的表达，以促进BMSCs分化，TFE可能通过激活该信号通路中的特定靶基因增强Runx2和Osx的表达，最终发挥治疗OP的作用。目前，对于TFE在Hedgehog信号通路上的具体靶点基因的研究极为少见。TFE的主要活性成分为淫羊藿苷（ICA），ICA能温肾补脾，是一类活性程度较高的多酚类物质，能够很好地提高骨质的重构率，抑制骨吸收，从而提高骨密度和骨质量，并对OP起到很好的防治作用［27］。ICA可以在骨重建过程中影响多种骨骼细胞的功能，以达到增强骨质，防治OP的作用，如ICA促进BMSCs向成骨细胞分化［28］。

2.2 中药复方 “肾主骨”理论在OP的防治上展现出中医独有的特色和优势。人体骨骼的变化是肾中精气盛衰的外在体现，人体骨骼只有在肾精的滋养下才能正常生长并保持坚固，肾中精气亏损，骨骼无以充养而失坚固［29］。补肾填精类中药复方很早便应用于临床对慢性骨代谢性疾病的治疗，特别是对OP的预防和治疗，具有良好的临床效果。中药复方则通过激活Hedgehog通路中的Shh、Gli1蛋白，从而控制下游基因的表达，以促使新骨生成，抑制骨骼吸收，达到预防OP的效果。

在补肾填精中药复方左归丸治疗OP的实验研究中，通过去除大鼠双侧卵巢建立绝经后OP模型，给予中药复方左归丸灌服，发现大鼠股骨和肾组织中Ptch1和Gli3 mRNA表达及其蛋白含量显著降低，股骨骨密度升高［11］。中药复方左归丸通过下调PTCH1和Gli3 mRNA表达，促进Hedgehog信号通路中下游靶点基因转录，促进骨形成，以提高骨密度。说明补肾填精中药复方左归丸能有效提高骨密度，具有防治OP的作用。在右归丸治疗OP的研究中，体外分离培养大鼠BMSCs，给予大鼠灌服右归丸，制备含药血清，实验组细胞培养液中混合含药血清连续培养15 d，酶联免疫吸附法检测出大鼠BMSCs中Shh、Ptc、Gli1含量均升高，表明右归丸可能通过调控Hedgehog通路中某些特定基因来影响OP发展过程［30］。研究发现，右归丸通过上调大鼠BMSCs中Shh含量，活化Hedgehog通路，Shh也可以促进Gli1及Ptc转录，进一步加快Hedgehog通路的转录过程，促使BMSCs向成骨分化。这可能是中药复方右归丸在预防治疗OP中的重要机制。梁学振等［31］采用培养液混合补肾活血胶囊含药血清干预大鼠股骨BMSCs，药物介导Shh和Gli1活化Hedgehog信号通路，以上调Runx2、Col1a1两个因子的表达，推动大鼠BMSCs向成骨分化；下调PPARγ、C/EBPα两个因子的表达，抑制大鼠BMSCs的成脂分化，继而调控大鼠BMSCs成骨与成脂分化之间的平衡，以加快新骨生成。

3 小结

中医学认为，OP的基本病机为肝肾亏虚、气滞血瘀，并通过应用补肾强骨、活血化瘀类中药取得了良好的临床效果。对OP病理分子机制的深入研究更加明确药物作用的信号通路及靶点，为中医防治OP提供基础研究和临床治疗的理论依据。在分子机制及信号通路层面研究发现，中药活性提取物通过对Wnt、OPG/RANK/RANKL、MAPKs、PI3K/Akt、BMPs、GABA、Hedgehog等多条信号通路中一条或多条通路的交叉调控，激活或抑制相关靶点基因，从而促进成骨功能或抑制破骨功能［13］，以达到骨代谢的最佳平衡，发挥抗OP的作用。本综述通过总结影响OP骨代谢的Hedgehog信号通路的某些补肾中药及复方的作用机制，认为中药对OP的干预过程可以做到一药多通路，一药多靶点来精准、有效地发挥调控作用。中药复方以君、臣、佐、使多元用药的方式相互辅助，又相互制约，从多通路、多靶点交叉调控影响成骨过程。

目前对于中药活性成分防治OP在信号通路层面的机制研究还存在局限，首先，中医用药是在中医基础理论、中医辨证论治的指导下进行的，而单纯的药理学研究并没有结合中医理论及辨证，只是分析药物中活性成分的作用。如果在药理学研究过程中结合中医理论及辨证，可能会对于中西医结合用药更有价值。其次，目前中药信号通路大多是基于一药一通路的研究，中药复方以多药多通路交叉调控为主，因此，对中医临床应用的研究要以中药调控不同通路之间的联系以及各通路之间是否有促进或抑制作用为主。此外，对于Hedgehog等保守信号通路的研究较少，缺少相关中药对其影响的实验研究，未来可以进一步深入研究保守通路作用机制及是否对其他相关通路有促进或抑制作用，以便于指导临床中医用药。

综上所述，补肾中药作用于Hedgehog信号通路在防治OP的发生中有重要的意义，对于临床中医用药有很好的指导意义。随着现代实验研究方式的不断创新，并不断融入中医理论及辨证论治的理念，不断突破中药对于分子机制和信号通路影响的研究，更加合理地指导OP在临床实践中的用药，OP的中药治疗将有重大突破。

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收稿日期：2022-12-05；修回日期：2023-01-27

基金项目：2021年甘肃省财政转移支付地方项目（20210140305）；兰州市科技计划项目（2022-3-30）