多聚磷酸盐聚合酶VTC复合体的结构和功能*

刘 伟 叶 升

（天津大学生命科学学院，天津 300072）

磷在生命活动中扮演核心角色，它是生物遗传物质核酸和细胞膜磷脂的重要组成成分，是生物细胞能量代谢的载体物质三磷酸腺苷（ATP）的结构元素，还是动物骨骼和牙齿的主要成分。自然界中大多数磷以不溶性的无机磷存在于矿物、土壤、岩石中，只有少量的可溶性磷，主要以无机磷酸盐（Pi）的形式为生命所利用。细胞对磷酸盐的需求随着细胞生理情况的变化而变化，在细胞分裂间期的S 期因DNA 复制而达到峰值。然而磷酸盐是所有核苷酸降解反应的产物，细胞质中过量的磷酸盐会改变核苷酸降解反应的平衡，降低反应的自由能，从而影响相关的细胞生理。细胞质磷酸盐供应不足会影响细胞的生长和分裂，而磷酸盐过量则会抑制细胞生理活动从而对细胞造成伤害。因此，细胞需要维持细胞质中磷酸盐的稳态，在满足自身对磷酸盐需求的同时防止细胞质中产生过多的磷酸盐对细胞造成伤害。磷酸盐稳态在所有生物体中都是一个受严格调控的过程，其功能障碍会导致人类肾范科尼综合征（Fanconi syndrome）［1］、植物生长迟缓［2-3］和微生物致死［4］等多种功能紊乱。

生物体从多个层次维持机体的磷酸盐稳态。在机体层面，多细胞生物（如人类）可以通过肾脏的过滤和重吸收维持体液循环中的Pi浓度［5-6］。他们可以获取骨骼中的磷灰石作为巨大的Pi储备。同时，人类组织在质膜中广泛表达受调节的Pi输出者（XPR1）［7］，这表明它们也可能保持对胞浆Pi峰值的保护。有趣的是，XPR1 也被发现与Pi在肾脏肾小管的重吸收有关［1］。对于植物来说，植物生长需要大量的Pi，但大多数土壤中的Pi水平是有限的，并且不断变化［8］。为了在自然界中生存克服这种Pi营养“胁迫”，植物不仅进化出了强大的Pi吸收和转运能力，还进化出了复杂的调控机制［9］，将多余的Pi储存在液泡中，以应对土壤Pi的变化状态。事实上，大部分（>90%）游离的Pi储存在植物细胞的典型液泡中［10］。在单细胞生物如酿酒酵母中，Pi的感知、获取和储存主要由磷酸响应信号通路（称为PHO 通路）介导［11］。在Pi缺乏的情况下，PHO 操纵子被触发，该操纵子控制一组旨在提高Pi摄入和Pi利用的基因。在酿酒酵母中，Pi获取系统由4个定位在细胞膜的Pi转运蛋白组成，其中2个低亲和力Pi转运蛋白质，即Pho87、Pho90普遍表达［12］，而2 种高亲和力Pi转运蛋白Pho84 和Pho89 由PHO 途径调节［13］。最初被认为是低亲和力Pi摄取系统的Pho91 最近被证明位于液泡膜上，并参与将Pi从液泡输出到细胞质［14］。有趣的是，Pho87、Pho90 和Pho91 都具有SPX 结构域，该结构域通常存在于参与调节Pi稳态的蛋白质中［15］。

为了在Pi的生物合成需求和胞质Pi浓度过高的风险之间实现微妙的平衡，细胞以无机多聚磷酸盐（polyP）的形式将Pi储存在膜结合的酸钙小体样细胞器中［16］。酸钙小体是从细菌到哺乳动物都保守的一类膜结合细胞器，但其功能尚不清楚。酵母细胞有一个类似的酸钙小体样细胞器，即液泡，它携带所有集中在酸钙小体中化合物的转运蛋白［17］。polyP 是由数十至数百个正磷酸盐残基通过高能磷酸酐键连接而成，存在于所有生物中。polyP 参与真核生物中的许多过程，包括激活炎症反应［18-19］、促进血液凝固［20］、促进软骨的发育和再生［21］、诱导癌细胞凋亡［22］、蛋白质多聚磷酸化修饰［23］以及调节离子通道活性［24］等。polyP 储存在酸性钙小体管腔中，同时多磷酸酶（Ppn1/Ppn2）也位于该管腔中。假设这些酶可以水解polyP，这可能允许释放的Pi再输出进入细胞质［25-26］。因此，酸钙小体样细胞器可能是胞浆Pi的重要缓冲装置。

酿酒酵母液泡转运蛋白伴侣（vacuolar transporter chaperone，VTC）复合体作为已知的真核生物多聚磷酸盐聚合酶，利用ATP在胞质中合成polyP，并将其转运到液泡中储存起来以维持细胞内Pi稳态。近年来，随着VTC 复合体的聚合酶和转位酶功能被鉴定［27-28］，polyP 合成和转运的偶联机制也被确定［29］。虽然目前已经获得了一些结构域的结构［27-28］，但是有限的信息限制了生理状态下VTC 复合体的组装、调控以及激活机制的研究。最近发表的完整VTC 复合体的结构极大地推动了对VTC复合体结构和功能的理解。

1 VTC复合体的研究现状

酿酒酵母VTC 复合体包含了至少4 个亚基：Vtc1、Vtc2、Vtc3和Vtc4，同源蛋白质在其他低等生物中也已经被发现［30-31］。Vtc1是一个仅包含3次跨膜螺旋的小整合膜蛋白。Vtc2、Vtc3 和Vtc4 在序列上高度同源，在C 端与Vtc1 共享类似的跨膜结构域，并具有在Pi稳态中起关键作用的N端SPX（Syg1/Pho81/XPR1）结构域和隧道形状的中心结构域（图1）。 酵母中Vtc4 的中心结构域（Vtc4189-480）已经被证实具有多聚磷酸盐聚合酶活性，而Vtc2 或Vtc3 的中心结构是无催化活性的［27］。最近还发现了VTC 复合体可能的第5 个亚基Vtc5［32］，该亚基由具有和Vtc2、Vtc3和Vtc4相似的结构域组成，但是序列相似性很低。Vtc5 对VTC 复合体的活性不是必需的，表明它是一个可选的调节亚基［32］。

Fig. 1 Domain composition of VTC complex subunits图1 VTC复合体亚基的结构域组成

Vtc4的中心结构域（Vtc4189-480）的结构揭示了一个隧道状的催化合成口袋（图2），而且重组表达的Vtc4 中心结构域具有聚合酶活性，能够利用ATP合成polyP［27］。Vtc4中心结构域的隧道状口袋分布着众多保守的碱性氨基酸（K200、R264、R266、K281、R361、K458）、丝氨酸（S457）和酪氨酸（Y359），这些氨基酸已经被证实在polyP合成中发挥着重要作用。Vtc4189-480与Pi、PPi、底物类似物AppNHp （adenosine-5'-[(β,γ)-imido]triphosphate） 和polyP 的晶体结构也已经被获得［27］。从Pi、PPi、AppNHp 到polyP，这些晶体结构或许暗示着VTC复合体利用ATP合成polyP并将其转运的过程。同时，PPi能够高度刺激Vtc4 催化结构域的polyP合成活性，Pi和PPPi刺激效果较弱。因此，PPi可能提供启动合成polyP链的引物。Vtc4的催化结构域对ATP 和dATP 具有相似的亲和力，对CTP 和GTP 的亲和力仅仅低5 倍。在晶体结构中，核苷部分没有结构，蛋白质仅与底物三磷酸腺苷的三磷酸部分发生相互作用。polyP 结合在Vtc4的隧道内，该隧道由保守的碱性残基组成，并包含活性位点。Vtc4 的中心结构域在结构上与RNA 三磷酸酶Cet1 相似［27］。虽然这些晶体似乎暗示着polyP 合成和转运的过程，但是由于缺乏完整VTC复合体的结构，难以确定生理状态下的polyP合成和转运过程。

Fig. 2 The crystal structure of the central domain of Vtc4 that combines different substrates and products图2 Vtc4的中心结构域与不同底物和产物的晶体结构

尽管VTC 蛋白的跨膜结构域和中心结构域序列在多细胞生物中并不保守，但是位于N端的SPX结构域在植物、苍蝇和哺乳动物中都被发现。包含SPX结构域的蛋白质已经被发现在调控Pi稳态方面发挥着重要作用。Vtc4 SPX 结构域的晶体结构显示包含6个α螺旋，其中2个小螺旋αI和αII形成N端螺旋发夹，以及由2 个长螺旋αIII 和αIV 以及C端2 个较小的螺旋αV 和αVI 形成的三螺旋束［28］。SPX结构域具有一个大的带正电荷的表面，分布着众多的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基在不同物种含SPX结构域的蛋白质中是高度保守的（图3）。

Fig. 3 The structure of SPXScVtc4 reveals a conserved ligand binding surface图3 SPXScVtc4的结构揭示了保守的配体结合表面

SPX 结构域能够与含磷酸盐的配体相互作用，但对Pi本身表现出很小的特异性和选择性。InsP6激酶Kcs1（其产生肌醇焦磷酸（PP-InsP）信号分子）的缺失消除了VTC 产生的polyP 储存，PP-InsP 可能调控体内polyP 的积累［33］。Gerasimaite 等［34］化学合成了5-InsP7，一种Kcs1 反应产物，并发现它在浓度高于100 nmol/L 时能够显著刺激VTC 催化合成polyP。相反，Pi和SO42-仅在毫摩尔浓度下才能激活VTC 复合体，InsP5、InsP4或InsP3不能刺激VTC催化合成polyP［28］。后续体内和体外证据都表明，5-InsP7是SPX 依赖性VTC 复合物的生理相关刺激因子。由于化学合成的5-InsP7含量很低，同时SPX结构域对5-InsP7和InsP6具有相似的亲和力，因此InsP6可以当做5-InsP7的商业化替代品用于后续功能和结晶实验。SPX结构域保守的碱性表面簇残基突变降低了VTC复合体的polyP合成活性，相反发现唯一一对突变Vtc3K126A/Vtc4K129A显著增强了VTC 复合体的polyP 合成活性［28］。研究还发现，Vtc3K126A/Vtc4K129A双突变也增加了酵母细胞内polyP含量［34］，这或许暗示双突变的VTC 复合体可能处于激活状态。

VTC 复合体可能以两种稳定的亚复合体形式存在，Vtc4/Vtc2/Vtc1 复合体和Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体。荧光定位实验显示：Vtc3 主要位于液泡膜上；Vtc2 的位置随环境中Pi浓度变化而变化［27］。当细胞处于Pi饥饿状态，Vtc2 主要定位在液泡膜上；当细胞处于Pi丰富的环境中，Vtc2在细胞内分布比较分散，分布在内质网膜、细胞核膜、线粒体膜和细胞膜等［27］。细胞可能需要存在两种不同的VTC亚复合体以创建具有不同调节的polyP池来响应不同的应急压力。与此相一致，polyP 不仅被发现集中在酸钙小体样液泡中，在细胞核中也有一个独特的polyP池，通过多聚磷酸化控制拓扑异构酶1（Top1）的定位和活性［23］。

近年来，关于VTC 复合体的研究取得了长足的进步，但是几个相关的基本问题仍然悬而未决。首先，生理状态下的VTC 复合体是如何组装的？虽然Vtc2 和Vtc4 中心结构域的结构［27］以及Vtc4 SPX 结构域的结构［28］陆续被获得，然而这些结构提供了有关VTC 复合体的化学计量比和组装的有限信息。因此，获得完整VTC 复合体的结构将有助于很好地理解VTC 复合体的组装。其次，VTC复合体的功能完整性。VTC 复合体不仅是一种polyP 聚合酶，也是一种polyP 易位酶。为了避免polyP在细胞质中积累的毒性，polyP合成和立即转运到液泡中是耦合的［29］。然而，这种耦合机制仍是不清楚的。最后，VTC复合体是如何调控polyP的合成？当胞浆Pi浓度足够高时，VTC复合体应合成polyP；而当胞浆Pi浓度较低时，VTC 复合体应关闭polyP 的合成，以避免从胞浆中耗尽Pi。VTC复合体的活性受到肌醇磷酸信号分子的调节，包括高度磷酸化、可扩散的肌醇多磷酸盐（InsPs）和肌醇焦磷酸盐（PP-InsPs）［28，34］。但是，目前尚不清楚这种调控机制。最近发表的完整VTC 复合体的结构对以上科学问题提出了见解，下面将着重介绍。

2 VTC复合体的结构

近年来，Vtc2和Vtc4中心结构域的结构［27］以及Vtc4 SPX结构域的结构［28］陆续被获得，然而这些结构提供了有关VTC 复合体的化学计量比和组装的有限信息。最近，完整VTC 复合体的结构被发表，包括本实验室解析的处于非激活态（apo state）的Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体［35］以及华中农业大学刘主课题组［36］解析的结合InsP6的激活态Vtc4R264A/R266A/E426N/Vtc3/Vtc1 复合体。这两篇文章都报道了Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体的结构，结构揭示了一个意想不到的异源五聚体，包含1 个Vtc4、1 个Vtc3和3个Vtc1亚基（图4）。每个亚基的3次跨膜螺旋（TM1~3）以赝对称的方式组装，形成圆柱形五聚体跨膜结构域。Vtc3 的胞质结构域和Vtc4 的胞质结构域形成非对称的异源二聚体。考虑到Vtc2 和Vtc3 在序列上是高度同源的，Vtc4/Vtc2/Vtc1复合体可能采取和Vtc4/Vtc3/Vtc1复合体相似的化学计量比和组装方式。

在本课题组的文章中，基于结构分析和功能数据，对polyP 的合成和转运、polyP 通道的门控机制及VTC 复合体的激活机制进行了研究。结构和体外polyP 合成实验都支持VTC 偶联polyP 聚合酶和转位酶活性。同时，利用纯化的液泡和5-InsP7以及1,5-InsP8等生理性配体对VTC 的功能展开了研究。结果发现，纯化的VTC 复合体以ATP-和肌醇多聚磷酸盐（PP-InsPs）依赖的方式合成polyP。进一步分析发现，只有Vtc4 的SPX 结构域对于polyP 的合成和PP-InsPs 调控是至关重要的，而Vtc3 主要通过磷酸化的loop 来调控polyP 的合成。该结构中，跨膜区形成一个polyP选择性通道，可能采用静息态构象，其中Vtc4 的闩锁状水平螺旋（HH）限制了polyP的进入。Vtc4的催化中心结构域位于赝对称polyP 通道的顶部，为新合成的polyP 创造了一个强正电性通路，该通路可以将合成与易位耦合。Vtc4 的水平螺旋以及亚基间多对保守的盐桥形成的“离子锁”有助于探究polyP通道的门控机制。基于以上结构和功能信息，推测了一个简化的VTC激活机制模型。

Fig. 4 Structure of the intact VTC complex图4 完整VTC复合体的结构

在华中农业大学刘主课题组的文章中，作者利用Vtc4 中心结构域的三突变（R264A/R266A/E426N）和PP-InsPs的商业化替代品InsP6解析了处于激活态的VTC的结构。他们发现，PP-InsP只是特异性结合在SPXVtc4，而非SPXVtc3，暗示只有SPXVtc4发挥感知PP-InsP 信号的功能。同样地，作者也证实VTC偶联polyP的合成和转运。此外，作者运用smFRET 技术，在单分子水平研究了VTC感知PP-InsP 信号后结构的动态变化。研究发现，PP-InsP 作为信号分子，它结合Vtc4，通过别构调控，诱导VTC的构象发生变化，使polyP的合成结构域向跨膜通道靠近，VTC 从抑制态转变为激活态，开启polyP的合成与转运。

虽然这两个结构是高度相似的，但是也存在一些差异。首先，在apo state中，Vtc4中心结构域的隧道状口袋中包含三磷酸盐-Mn2+，这可能与复合体的内源性表达相关，相反，在InsP6结合的激活态中，Vtc4 中心结构域的隧道状口袋被一个InsP6分子占据，这或许是因为1 mmol/L 的InsP6并非生理浓度而导致的非特异性结合。除此之外，结构中还包含另外2个InsP6分子，1个结合在Vtc4 SPX结构域的肌醇多磷酸盐（PP-InsPs）结合表面，另外1 个结合在Vtc3 和Vtc4 的中心结构域之间，可能促进了这两个结构域的结合（图4）。其次，在靠近胞质侧转运通道的入口处，在apo state中，Vtc4的一段水平螺旋（horizonal helix，HH）横跨在入口，堵塞polyP的进入，相反，在InsP6结合的激活态中，两个磷酸盐分子在通道入口处（图4）。再次，在apo state 中，由Vtc1 的M42、Vtc3 的L716和Vtc4的L640 组成了转运通道的最窄点，直径仅有4 Å，小于polyP 的鲍林半径（3 Å），不允许polyP 通过，而在InsP6结合的激活态中，Vtc1 的R31、Vtc3的R709和Vtc4的R629组成了转运通道的最窄点，直径仅有3 Å，同样地不允许polyP 通过。最后，在apo state 中，内源性表达的Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体具有完全的polyP 合成活性，相反，在InsP6结合的激活态中，包含3 个突变的Vtc4R264A/R266A/E426N/Vtc3/Vtc1复合体的polyP合成活性被完全废除。这两个处于不同状态的结构展示了完整VTC 复合体的化学计量比和组装方式，极大地推动了后续VTC复合体的功能研究。

3 VTC复合体的功能

酵母中polyP 聚合酶是一种大型膜蛋白复合物，最初被命名为VTC［30］。在其polyP聚合酶的催化活性被确定之前，VTC 复合物被发现是V-ATP酶稳定性和运输、酵母液泡膜融合和微自噬所必需的［31，37-38］，但是目前并不清楚是polyP还是VTC复合物本身参与了这些过程。VTC 复合体作为唯一已知的真核生物polyP聚合酶，利用ATP在胞质中合成polyP，并将其转运到液泡中储存，以维持细胞内Pi稳态。因此，VTC复合体具有polyP聚合酶和转位酶的双重功能。在细胞内，VTC 复合物的活性受到肌醇磷酸盐信号分子的调节，包括高度磷酸化、可扩散的肌醇多磷酸盐（InsPs）和肌醇焦磷酸盐（PP-InsPs）［28，34］。具体研究详述如下。

3.1 VTC复合体偶联polyP的合成和转运

VTC复合体不仅是一个polyP聚合酶，还是一个polyP 转位酶。为了避免polyP 在胞质中的积累对细胞造成的毒害作用，polyP 的合成和立即转运到液泡是偶联的［29，39］。最近获得的两个完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体的结构都清晰地支持这种偶联机制［35-36］。

在完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体的结构中，Vtc4的中心结构域和跨膜结构域是共价连接的（图5）。Vtc4作为催化亚基，负责polyP的合成，Vtc4敲除显著降低细胞内polyP含量［40］。Vtc4中心结构域的隧道状口袋分布着众多保守的碱性氨基酸（K200、R264、 R266、 K281、 R361、 K458）、 丝 氨 酸（S457）和酪氨酸（Y359），这些氨基酸已经被证实在polyP合成中发挥着重要作用［27，35］。一段由众多碱性氨基酸（R196、 R253、 K256、 K291、K294、R373、K428、K455、R618）组成的蜿蜒曲折通道连接了Vtc4 中心结构域的活性位点和跨膜通道入口，暗示新生的polyP可能从此通道行进到跨膜孔，从而完成跨膜转运。这一结构信息为polyP 合成和转运的偶联机制提供了理论支持。同时，这些碱性氨基酸突变成酸性氨基酸也已经被证实能够显著降低细胞内polyP的含量［35］。

Fig. 5 The structure of the Vtc4 /Vtc3 /Vtc1 complex supports a coupled mechanism of polyP synthesis and transport图5 Vtc4/Vtc3/Vtc1复合体的结构支持polyP合成和转运的偶联机制

Vtc4、Vtc3和3个Vtc1的跨膜螺旋以赝对称的方式排列成异源五聚体。每个亚基的TM1 螺旋形成圆柱体的内环作为polyP转运的核心通道，每个亚基的TM2 和TM3 螺旋形成圆柱体的外环包裹着内环。在apo state 和InsP6-activated state 结构中，由于最窄点直径都小于polyP直径，因此，跨膜转运通道都不允许polyP通过。同时也发现，在靠近胞质侧转运通道的入口处，在apo state中，Vtc4的一段HH 横跨在入口，堵塞polyP 的进入，相反，在InsP6结合的激活态中，2个磷酸盐分子在通道入口处（图4）。由于2个结构被捕获在不同的功能状态，因此结构差异也是合理的。

生化实验也显示，单独表达的Vtc4 中心结构域表现出很低的polyP合成活性，而完整的VTC复合体在体内具有很高的活性［27，29］，而且相比于去垢剂溶解的VTC 复合体，携带VTC 复合体的液泡表现出超过100 倍的polyP 合成活性［29］，这表明VTC 复合体的完全催化活性需要一个完整的膜环境。因此，提出polyP合成和转运的偶联机制也是合理的，其中来自跨膜区域的驱动力将新生的polyP 链拉入跨膜通道进行转运，从而将带负电的聚合物从带正电的催化中心排出，并允许添加新的磷酸盐残基。

3.2 肌醇多磷酸盐（PP-InsPs）调控polyP的合成

VTC复合体精确调控polyP的合成对于维持细胞内Pi稳态是必需的。包含SPX结构域的蛋白质已经被发现在调控Pi稳态方面发挥着重要作用［41］。单独表达的SPX 结构域能够与含磷酸盐的配体发生相互作用，但对Pi本身表现出很小的特异性和选择性［28］。PP-InsPs 也被发现在控制酵母和哺乳动物细胞磷酸盐稳态中发挥着重要作用［42-43］。VTC复合体的polyP合成活性在体内收到肌醇焦磷酸盐（5-InsP7和1,5-InsP8等）的调控［28］，同时肌醇磷酸盐（InsP6）也被发现在体外能够刺激VTC 复合体合成polyP［28，35-36］。

SPX结构域存在于所有真核生物中，并具有共同的序列和结构特征，保守的赖氨酸残基形成肌醇多磷酸盐和焦磷酸盐的高亲和力（亚微摩尔）结合位点［28］。纯化的SPX 结构域在结合不同的肌醇多磷酸盐或焦磷酸盐异构体方面表现出相对较低的选择性，并且它们的亲和力随化合物的净电荷降低而降低（InsP8>InsP7>InsP6）［34］。与低选择性形成鲜明对比的是，不同异构体的激动剂性质差异很大。例如，VTC复合体被1,5-InsP8强烈激活，但被携带相同数量磷酸基团的5-PPP-InsP5激活效果非常弱［34］。同样地，5-InsP7激活VTC，而InsP6几乎没有作用［34］。因此，尽管肌醇多磷酸盐具有极高的电荷密度及其类似的结合亲和力，SPX结构域必须解码配体的精确结构特征，并将其转化为不同程度的活性。

酿酒酵母的基因组包含10 个编码SPX 结构域的蛋白质，其中8种蛋白质具有与Pi代谢相关的功能。它们分别是：2 个低亲和力Pi转运蛋白质Pho87 和Pho90 定位在细胞膜上［13，44］；Pho91 位于液泡膜上并参与将Pi从液泡输出到细胞质［14］；细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂Pho81［45］；甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶1（Gde1），可水解甘油磷酸胆碱，从而释放胆碱和甘油3-磷酸，可作为Pi来源［46］；酵母gpa1 抑制剂（Syg1）［47］和Ydr089（最近被鉴定为Vtc5）［32］；多聚磷酸盐聚合酶VTC复合体的3个 亚 基Vtc2、Vtc3 和Vtc4［48］。除 了Syg1 和Ydr089 之外，所有含有SPX 结构域的酵母蛋白都被证明是维持酵母中Pi稳态的关键调节因子。

Vtc3和Vtc4 SPX结构域的结构是高度相似的，135个Cα原子的均方根偏差为1.7 Å。相比于Vtc4，Vtc3 的SPX 结构域在C 端还包含1 个额外的螺旋αVII，与αIV 和αVI 螺旋形成疏水相互作用（图6）。两个SPX 结构域都具有由螺旋αII 和αIV 上的多个保守赖氨酸残基形成的带正电荷的表面（图6），并且可以与含磷酸盐的配体相互作用，在之前的研究中猜测两者都是PP-InsPs 的受体［28］。最新的研究发现，不论是对SPX 结构域进行截断［35］，还是对SPX 结构域上的保守赖氨酸残基突变［36］，携带突变体的VTC复合体体外polyP合成实验结果都表明，只有Vtc4 的SPX 结构域能够作为PP-InsPs感受器，响应polyP合成和PP-InsPs调节。与此相一致，在InsP6-activated state 结构中，InsP6只结合在Vtc4 的SPX 结构域上（InsP6A）［36］。同时，在Vtc3 和Vtc4 的中心结构域之间也发现了一个InsP6B，可能促进了这两个结构域的结合［36］。

除此之外，研究人员还发现，Vtc3 通过磷酸化的loop 调控polyP 的合成［35］。在Vtc3 的非催化中心结构域中存在一段不同寻常的loop（残基234~292），在该loop 的C 端包含一簇磷酸化位点。研究人员通过取代6 个丝氨酸残基（S263、S265、S267、S269、S270、S274）为丙氨酸或天冬氨酸来模拟该loop 的非磷酸化和磷酸化状态，证实该loop 的磷酸化对polyP 的合成具有负调节作用。结合PP-InsPs 对VTC 复合体的调控作用，该loop 可以增强VTC调节polyP合成活性的动态范围，支持在Pi缺乏的情况下完全停止polyP 合成，同时在Pi充足时保持完全激活的潜力。

Fig. 6 Structure of the SPX domain of the VTC complex图6 VTC复合体的SPX结构域的结构特征

3.3 VTC复合体的激活机制

完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体的结构揭示了一个意想不到的异源五聚体组装，包含1 个Vtc4、1 个Vtc3 和3 个Vtc1 亚基。Vtc4 中心结构域与跨膜区的连接以及二者之间形成的转运通道结构清晰地支持polyP合成和转运的偶联机制。Vtc4的SPX结构域作为PP-InsPs 感受器，响应polyP 合成和PP-InsPs 调节。Vtc3 通过磷酸化的loop 调控polyP的合成。基于这两个处于不同功能状态的Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体结构和功能信息，允许大家合理地推测一个VTC复合体的激活机制。

在apo state结构中，研究人员提出了一种可能的polyP通道门控机制［35］。首先，作者发现由TM1螺旋组成的polyP 通道的五重对称性被破坏。同时，观察到形成界面的2个跨膜结构域具有不同的相对位置，其中Vtc1（β）-Vtc1（γ）和Vtc3-Vtc4紧密堆积，Vtc1（γ）-Vtc3松散堆积，Vtc1（α）-Vtc1（β）和Vtc4-Vtc1（α）介于二者之间。相应地，Vtc3-Vtc4掩埋了最多的蛋白质表面积（4 150 Å2），接下来分别是Vtc1（β）-Vtc1（γ） （2 920 Å2）、Vtc4-Vtc1（α）（2 870 Å2）和Vtc1（α）-Vtc1（β） （2 660 Å2）。Vtc1（γ）- Vtc3 相互作用界面掩埋了最少的蛋白质表面积（2 350 Å2），这一数据也与观察到的VTC 通道不对称性相一致。有趣的是，在以疏水相互作用为主的亚基相互作用界面中心发现了几对特殊的盐桥，将其命名为亚基间“离子锁”。其中Vtc1 的E30 和R83、Vtc3 的E704 和R762，以 及Vtc4 的E628 和R681 都是非常保守的（图7a）。基于此，作者假设polyP通道在静息状态下被捕获，入口由Vtc4 的闩锁状水平螺旋固定。Vtc4 的水平螺旋在通道入口处的不对称排列对polyP通道施加了不对称的力，导致亚基间相互作用界面的相对位置不同。3 个松散堆积的亚基间相互作用界面，加上2个紧密堆积的亚基间相互作用界面，使得由TM1螺旋形成的通道直径从胞质侧向液泡内侧逐渐变窄，形成一个可能用作门控的最窄点。亚基间的“离子锁”可以将各亚基维持在一起。然而，在polyP 通道打开期间，水平螺旋闩锁被抬起，VTC复合体的各亚基被“离子锁”拉在一起，可能导致亚基之间形成所有的5个“离子锁“。在这种状态下，TM1 螺旋可能在胞质侧向内倾斜，在液泡侧向外倾斜，从而打开通道（图7b）。

相反，在InsP6-activated state 结构中，作者认为PP-InsPs 的结合使得Vtc4 的中心结构域向跨膜通道入口靠近，从而偶联polyP 的合成和转运［36］。作者认为Vtc4 中心结构域的取向主要由Vtc4 中心结构域与跨膜结构域间的连接以及与Vtc1（α）的N端（残基1~21）之间相互作用来维持。其中Vtc1（α） N端的敲除会降低VTC复合体的催化活性，完全废除液泡polyP的产生。为了阐明Vtc1的N端缺失是否会导致Vtc4 催化结构域的运动，作者进行了单分子荧光共振能量转移（smFRET）分析，这是一种单分子水平表征蛋白质动力学和构象变化的方法。实验结果显示，InsP6的结合使得Vtc4 的中心结构域靠近跨膜结构域，远离跨膜结构域。而且，Vtc1 的N 端缺失会导致VTC 复合体不再被InsP6激活。

基于处于不同功能状态的2 种Vtc4/Vtc3/Vtc1复合体的结构，本课题组推测了一个可能的VTC复合体的激活机制（图7c）。我们认为VTC复合体包含1个polyP聚合酶和1个polyP通道，并在非活性状态和活性状态之间平衡存在。在非活性状态，Vtc4 的中心结构域远离跨膜通道，polyP 合成和转运的偶联机制被破坏，具有很低的聚合酶活性，同时Vtc4 的水平螺旋HH 堵塞在通道入口使得polyP转运通道处于关闭状态；在肌醇磷酸等信号分子的刺激下，Vtc4的中心结构域在Vtc1（α） N端的帮助下靠近polyP 转运通道，完成polyP 合成和转运的偶联，同时，Vtc4的水平螺旋HH远离通道入口使得polyP转运通道处于开放状态，VTC复合体从非活性状态快速转变成活性状态，高效催化ATP 合成polyP。

Fig. 7 Activation mechanisms of the VTC complex图7 VTC复合体的激活机制

进一步，之前的研究也报道了液泡polyP 的合成需要一个跨膜电化学势能，可能由位于液泡上的V-ATPase 提供［29，49］。在体内，通过添加V-ATPase的抑制剂可以抑制液泡polyP 的合成；同时，V-ATPase 亚基Vph1 的敲除会使得酵母细胞内polyP含量降低20%（相比野生型）［29］。基于polyP合成缺陷突变体的高通量筛选已经识别了超过250种相关基因，其中也包括V-ATPase 的几个亚基［50］。因此，跨膜区内外的质子梯度及其对细胞应激的变化或许将调节VTC 的活性，如通道本身的构象变化，从而刺激polyP的合成和跨膜转运。

4 总结与展望

酿酒酵母VTC复合体作为已知的真核polyP合成酶，通过偶联polyP的合成和转运过程来维持细胞内Pi稳态。近十年来，随着VTC 复合体的相关研究逐渐增多，其结构信息和作用机制也越来越清晰。最近发表的完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体的结构极大地推动了对VTC 复合体结构和功能的理解。完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体的结构揭示了一个异源五聚体组装，结构和功能信息都支持polyP合成和转运的偶联机制。Vtc4的SPX结构域作为PP-InsPs感受器，响应polyP 合成和PP-InsPs 调节，同时Vtc3 通过磷酸化的loop 调控polyP 的合成。基于Vtc2 和Vtc3 在序列上的高度同源，Vtc4/Vtc2/Vtc1复合体可能采取和Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体相似的化学计量比和组装方式。目前还不清楚酵母细胞内为什么存在两种VTC复合体。相比Vtc4/Vtc3/Vtc1复合体只定位在液泡膜上，Vtc4/Vtc2/Vtc1 复合体在酵母细胞的定位随环境中Pi的浓度而发生变化，这种广泛的分布（细胞核膜、线粒体膜、细胞膜和液泡膜等）或许暗示Vtc4/Vtc2/Vtc1 复合体不仅具有polyP 聚合酶和转位酶活性，或许还参与细胞内其他生物学功能。因此，解析Vtc4/Vtc2/Vtc1 复合体的结构对于理解VTC 复合体的作用机制也是十分有帮助的。最近，虽然发表了处于两种不同功能状态的Vtc4/Vtc3/Vtc1 复合体结构，但是二者结构的高度相似性或许暗示VTC 复合体的激活可能不需要大的构象转变，目前的结构信息还不足以阐明VTC 复合体的分子作用机制。因此，未来获得其他功能状态的结构（包括polyP催化合成的不同阶段以及转运通道完全开放状态的结构等）对于理解VTC复合体的分子作用机制是十分重要的。