非编码RNA 在动物繁殖中的研究进展

陈玉林，刘玉芳，储明星

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

非编码RNA（Non-coding RNA，ncRNA）是一类由DNA 转录而来，不参与编码蛋白质，占真核生物基因组90%的功能性RNA。随着生物学的发展，已有大量的研究证实，ncRNA 在动物繁殖进程中具有重要的调控功能，主要在转录和转录后水平上调节基因表达。在种类众多的ncRNA 中，小分子RNA（microRNA，miRNA）与长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）的研究颇为广泛，因此，本文查阅相关资料，对miRNA 和lnc-RNA 的作用机制及其在动物繁殖领域的研究进展作一综述，以期为相关研究提供理论参考。

1 miRNA 的作用机制及其在动物繁殖中的研究进展

1.1 miRNA 的作用机制

1993 年，Lee 等［1］在秀丽隐杆线虫中发现了首个不具备编码蛋白功能的lin-4基因，发现由该基因产生的两条较短的RNA 分子可以互补结合到另一相关基因lin-14的3’非翻译区（3’untranslated region，3’UTR），起到调控lin-14 的蛋白合成量的作用。随后，Liu 等［2］发现了不具有编码蛋白功能的let-7基因，其结构与功能和lin-4基因十分相似，因此，此类基因一度被称为小时序RNA（Small temporal RNA，stRNA）。2001 年，在Science杂志中首次出现“micro RNA”一词［3］，此后不断发现此类具有相同特点的基因，即长度为22 nt，由具有茎环结构的前体加工而来，且在进化中比较保守的内源性分子。随着越来越多的miRNA 被发现，人们开始意识到miRNA参与转录后调控这一现象的普遍性及重要意义［4］。由miRNA 介导的基因调控方式已成为当前该领域的研究热点。

microRNA 从DNA 转录而来，但不具有翻译为蛋白质的功能，由具有茎环结构的前体转录产物剪切成为成熟的microRNA。除了长度与来源的特征之外，成熟miRNA 还需经由Dicer 酶加工，且其本身和前体一般都具有物种间的保守性［5］。miRNA 通常不能单独工作，必须形成效应核糖核蛋白复合物——RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complexes，RISCs）以发挥其功能［6］。因此，RISC 的组装是由miRNA 介导基因功能沉默的一个关键过程。在此过程中，一个小的RNA 双链被结合到AGO 蛋白中，形成一个命名为Pre-RISC 的中间复合体。在成熟过程中，双链的伴随链（Passenger strand）从AGO 中排出，而另一条链仍然与AGO 结合形成RISC 并为其引导沉默靶RNA［7］。而miRNA 沉默mRNA 的方式根据mRNA 的不同特性而有所差异。

此外，miRNA 的主要作用机制还包括以下3 个方面：①抑制基因翻译功能。一些miRNA 与靶mRNA 并不完全互补，可通过与mRNA 的3’UTR 区域较为松散地结合，导致miRNA 在蛋白质翻译水平上抑制靶基因表达。②影响mRNA 的降解。miRNA 也有可能影响mRNA的稳定性。如果miRNA 与靶位点完全互补（或者几乎完全互补），那么这些miRNA 的结合往往引起靶mRNA 的降解。通过这种作用机制的miRNA 的结合位点通常都在mRNA 的编码区或开放阅读框中。每个miRNA 可以有多个靶基因，而几个miRNAs 也可以调节同一个基因。③转录调控功能。除遗传学调控方式之外，miRNA 还可通过表观遗传学层面诱导基因沉默，如基因启动子的甲基化、乙酰化、组蛋白修饰等机制。最近研究发现，miRNA影响基因启动子的CpG 岛甲基化作用，在转录水平直接对靶基因进行调控。

1.2 miRNA 在动物繁殖中的研究进展

miRNA 是各种细胞活动的强大调节器，包括细胞生长、分化、增殖、发育和凋亡以及突触可塑性等，且在发育和疾病中起到重要的调控作用。近年来，越来越多的研究表明，miRNA 在动物繁殖相关过程中起着重要作用。许多繁殖相关疾病中都检测到miRNA 的异常表达［8-9］。miRNA 在卵母细胞发育早期、卵泡发生、卵母细胞成熟、胚胎发育和着床中发挥着不同的生物学功能［10］。

1.2.1 miRNA 靶向mRNA 调控动物繁殖性状

miRNA 可在转录后调控mRNA 的表达。Przygrodzka等［11］在研究相关影响卵巢功能的miRNA 时发现，miR-99b可以通过降低NR4A1和AKR1C1的表达增强孕酮的分泌，从而维持黄体功能以及参与黄体退化。Li 等［12］研究了TGF-β1对卵巢颗粒细胞的影响，发现19 个miRNA通过靶向TGF-β1参与调控细胞发育状态，如细胞周期、增殖、应激和炎症反应等。Liu 等［13］通过对高、低产山羊卵巢组织的转录组测序发现，miR-1271-3p 通过抑制TXLNA的表达抑制了颗粒细胞的增殖。miRNA 与mRNA之间的靶向调控为研究动物繁殖性状提供了新的角度。

1.2.2 miRNA 在动物生殖细胞中的研究进展

Robles 等［14］研究发现，多个miRNA 在雌性小鼠的性腺发育中起重要作用，miR-290-295 和miR-17-92 基因簇对小鼠生殖细胞的发育起调节作用，而在其他脊椎动物，如鲫鱼、斑马鱼等的研究中也发现，许多miRNA 在原始生殖细胞的发育和维持中发挥着重要的作用［15-16］。Hadeel 等［17］研究发现，miR-17-92 簇在接近减数分裂前期的小鼠原始生殖细胞中大量表达，而miR-17-5p、miR-18、miR-19a 和miR-19b 的表达量逐渐降低。Ebrahim 等［18］研究发现，不同的miRNA 在不同信号通路中对卵泡的发育起相反作用，如miR-376a 可通过调节小鼠原始卵泡中增殖细胞核抗原基因表达促进其增殖，而miR-125b 则通过调节激活素A 受体2A（ACVR2A）的表达来抑制原始卵泡的组装［19］，miR-145 通过调节转化生长因子受体2 的表达，启动原始卵泡的发育并维持原始卵泡的静止［20］。以上研究证明，miRNAs 在原始生殖细胞发育、功能的启动和形成过程中具有重要的调控作用。

1.2.3 miRNA 在卵巢功能中的研究进展

miRNA 在小鼠卵巢基本功能，如排卵、类固醇生成和黄体发育等方面具有一定的影响。Li 等［21］研究发现，3个miRNA（miRNA-224、miR-378 和miR-383）在卵泡细胞的发育中负责调节芳香化酶的表达。Pei 等［22］对小鼠卵巢的研究证明，miR-320 可诱导雌性小鼠睾酮和孕酮合成，而过量表达则可提高或者减少雌二醇的产生［23-24］。Zhang 等［25］在对不同哺乳动物的卵巢miRNA 谱进行全基因组水平研究时发现，miRNA 在由颗粒细胞凋亡导致卵泡闭锁的过程中起着关键作用，其在卵巢中卵泡的生长和成熟过程中非常关键。正常的受精和胚胎发育依赖于卵母细胞的正常生长和成熟，这一过程需要卵母细胞与周围的卵泡细胞进行充分的沟通。与卵母细胞不同，卵丘是卵泡内围绕卵母细胞的一组细胞［26］。研究表明，相同的miRNA（miR10A、miR-100 和miR184）在人类成熟中期卵母细胞中的表达丰度与环绕的卵丘细胞中的不同［27］。因此，研究miRNA 在卵巢功能中的作用对于卵巢疾病的治愈具有重要意义。

1.2.4 miRNA 在胚胎发育中的研究进展

在胚胎植入之前，需经历一个称为胚胎基因组激活的关键事件，胚胎的进一步发育依赖于胚胎基因组产生的转录本和蛋白质［28］。研究证明，miRNA 的转录对胚胎基因组的激活具有一定的依赖性。如母体mRNA 的降解和清除可通过miRNA 介导的从头合成促进去烯基化来完成［29］，miR-430 参与促进斑马鱼早期胚胎发生期间母体mRNA 的去腺苷化和清除［30］，miR-130a 和miR-21 均被证实在胚胎基因组激活后表达量逐渐增加，而在α-鹅膏蕈碱（α-amanitin）处理的胚胎中表达量显著降低，进一步证明胚胎基因组激活中一些miRNA 的重要性［29］。在胚胎动态发育过程中，不同miRNA 也随之具有不同动态表达变化。在牛囊胚的研究中，一些miRNA 被发现在早期囊胚中的表达高于孵化囊胚，而另一些miRNA 则在孵化囊胚中具有较高表达［31］。

1.2.5 miRNA 在子宫中的研究进展

子宫是胚胎着床的重要器官，miRNAs 在子宫生理、生殖道发育、子宫内膜容受性和胚胎植入等方面的重要性已被多次证明。有研究表明，在小鼠胚胎植入过程中起关键作用的环氧合酶-2 的表达受到miR-199a 和miR-101a 的转录后调控［32］，miR-200a 的过表达减少了小鼠子宫内着床部位的数量［33］，而miR-451 则被报道通过靶向Ankyrin 重复结构域46（ANKRD46）基因来调节小鼠胚胎着床，从而影响小鼠的妊娠率［34］。在小鼠胚胎以及人类胚胎干细胞中鉴定出来的miRNA 被证实也在人类囊胚中检测到表达。而在胚胎着床前后以及子宫内膜着床点与非着床点的比较中，不同种类的miRNA 的表达谱均具有不同的动态变化。如在小鼠模型的研究中，30 个miRNAs 的表达增加，而42 个miRNAs 的表达在妊娠第5 天时与植入间部位相比降低［35］。小鼠胚胎植入后，let-7a 在子宫腺上皮和腔上皮中有较高的表达［36］。因此，研究miRNA 在子宫中的作用机制可为提高动物着床率提供新的方法。

1.2.6 miRNA 在繁殖相关疾病中的研究进展

由于miRNA 在卵巢、胎盘和子宫内膜功能等方面具有重要的调控作用，miRNA 表达异常的累积往往会导致多种生殖相关疾病如多囊卵巢综合征（Polycystic ovarian syndrome，PCOS）、卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）或原发性卵巢功能不全等［37-38］。因此，对miRNA 的深入研究不仅可以作为未来的诊断工具，还可以在相关疾病的治疗中开辟一种新的方式［39］。

2 LncRNA 的作用机制及其在动物繁殖中的研究进展

2.1 LncRNA 的作用机制

LncRNA 是一类长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，由RNA 聚合酶Ⅱ催化转录而来，通常在5’和3’端分别具有M7G 帽子和poly A 尾结构，剪切方式类似于mRNA，但不具有编码蛋白的能力。LncRNA 可在基因表达的不同阶段、不同层次、不同水平进行调控，如表观遗传、转录和转录后等，在转录沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等均具有重要的功能［40-41］。LncRNA 还可与染色质重构复合体结合，改变染色质结构和转录过程［42］。LncRNA 的作用机制主要有以下4 种：①LncRNA 通过传导信号发挥作用。在不同的刺激条件和信号通路下，一些lncRNA 将会被特异性地转录，并会作为信号传导分子参与特殊信号通路的传导［43］。比如lncRNA 可以直接结合染色体中临近位置的DNA 调节基因表达，即顺式调控模式（Cis-regulation）。此种作用机制主要涉及到等位基因特异性、基因的特异性表达、DNA 损伤诱导、多能性与重编程、寒冷诱导、增强子RNA 为代表的协同活性以及重复检测等。②LncRNA 通过充当分子阻断剂发挥作用。这一类lncRNA 被转录后，会充当内源竞争RNA（Competing endogenous RNAs ，ceRNA）直接和RNA/蛋白（转录因子/转录调节子）结合，从而阻断了该分子的作用和信号通路［44］，这其中就包括了DHFR 次要启动子、含有端粒重复序列的非编码RNA（TERRA）、p21 相关非编码RNA（PANDA）、糖皮质激素受体、miRNA 及剪接因子的分子诱饵。③LncRNA 通过与相关蛋白结合发挥作用。这类lncRNA 类似于伴侣分子，与蛋白结合后，可将蛋白复合物定位到特定的DNA 序列上，从而调控下游分子的转录［45］。④LncRNA 在结构学方面起到的作用使其具有分子支架的“平台”功能，即多个相关的转录因子可以结合在同一个lncRNA 分子上，从而实现不同转录因子之间的相互作用，有助于通路的激活、信息交汇与整合，有利于机体的各种生理反应和调节。

2.2 LncRNA 在动物繁殖中的研究进展

2.2.1 LncRNA 竞争性结合miRNA 调控动物繁殖性状

lncRNA 在基因调控中起重要作用，即lncRNA 能够通过与相关的miRNAs 竞争性结合来调节mRNA 的功能。在PCOS 的研究中，Ma 等［46］构建了与PCOS 相关的lncRNA-mRNA 网络（PCLMN），发现其中的关键lncRNA与炎症、氧化应激和细胞凋亡相关的过程和途径有明显的关联。Wu 等［47］在鸭卵巢卵泡的研究中发现，lnc_13814直接结合并抑制apla-miR-145-4，然后增加了DDIT3 的表达并上调颗粒细胞的凋亡。Liu 等［48］研究发现，在卵泡颗粒细胞中lncRNA PVT1 与miR-17-5p 存在结合情况，而miR-17-5p 可以靶向调控PTEN基因表达，因此，lnc-PVP1 的抑制和miR-17-5p 的过度表达会导致PTEN基因的下调，促进细胞增殖，并抑制PCOS 中卵泡颗粒细胞的凋亡。CeRNA 作为一种基因表达调控模式，为研究lncRNA 在动物繁殖中的作用提供了新的角度。

2.2.2 LncRNA 在卵巢卵泡颗粒细胞中的研究进展

作为与繁殖直接相关的器官，卵巢的生长发育状态直接关系到动物繁殖力的高低，而lncRNA 在卵细胞发育中也起着不可忽视的作用。卵泡的发育实质上就是卵母细胞在周围颗粒细胞提供的营养和结构支持下与周围卵泡膜细胞相互调控的过程。Karlic 等［49］使用二代测序和新的转录本组装来定义卵母细胞到胚胎的转变（The oocyte-to-embryo transition，OET） 期间表达的1 600 个lncRNAs 的核心群体，经过分析发现，快速演变的lnc-RNAs 构成了原生细胞的特征，其中只有少数在控制整个OET的基因表达方面发挥着积极作用。以上研究进一步证明了lncRNA 参与调控卵泡细胞的生长过程。Li 等［50］认为，LncRNA 可以通过多种机制调节基因表达，是颗粒细胞、卵泡和卵巢正常发育的关键调节因素。Yao 等［51］在对闭锁卵泡的高通量测序数据进行分析发现，lncRNA NORHA 通过影响颗粒细胞的凋亡参与卵泡闭锁。Li等［52］在高、低产山羊的卵巢测序数据中也发现，一些lncRNAs 在调控卵泡发育和颗粒细胞生长方面起着关键作用。因此，lncRNA 在卵巢卵泡中具有重要的功能。

2.2.3 LncRNA 在生殖干细胞中的研究进展

Li 等［53］在对不同性别的小鼠生殖干细胞进行高通量测序后，发现多个lncRNAs 在小鼠生殖干细胞中存在性别差异，证明lncRNA 可能在生殖干细胞的发育过程中起重要的调控作用。Guo 等［54］在对人类与小鼠的胚胎干细胞中的lncRNA 进行不同亚细胞定位后，发现与小鼠胚胎干细胞相比，人类胚胎干细胞的细胞质中定位的lncRNA 的比例明显更高，不仅表明lncRNA 比mRNA 进化的更快，也证明lncRNA 的加工和定位对于干细胞功能的快速演变起到了重要的作用。其中包括lncRNA Gas5、lncRHOF1 都被发现在生殖干细胞的生长过程中起关键作用［55-56］。

2.2.4 lncRNA 在繁殖相关疾病中的研究进展

在对多囊卵巢综合症的研究中发现，lnc-MAP3K13-7：1 等可以通过抑制颗粒细胞增殖，导致异常卵泡发生（Abnormal folliculogenesis）［50，57-58］，而lncRNA HCP5 则通过损害DNA 损伤修复并促进颗粒细胞的凋亡，参与到卵巢早衰（Premature ovarian insufficiency，POI）这一遗传病当中［59］。lncRNAs 不仅在正常卵泡颗粒细胞中发挥作用，而且还可能是病理条件下颗粒细胞的潜在候选标志物和治疗目标。以上研究证明，lncRNA 在繁殖相关疾病中起到重要作用，在疾病治疗方面具有很大潜力。

3 结语

作为具有重要功能的非编码RNA，miRNA 和lnc-RNA 的作用机制随着研究的不断深入愈加明晰并逐渐完善，其中miRNA 主要通过与靶基因结合或者参与组装成为RICS 发挥作用，lncRNA 则主要根据其所处的位置通过与上下游基因结合发挥功能或者与相应转录因子结合起到调控转录及功能整合的作用。但由于miRNA 及lncRNA 功能的多样化，其复杂机制仍未完全阐明，如miRNA 曾被报道结合至靶基因5’UTR 起到上调基因表达的作用，以及由增强子转录而来的lncRNA 即eRNA发挥作用的调控机制，仍有待进一步探究。与此同时，越来越多的miRNA 及lncRNA 被发现通过不同的方式参与调控动物的繁殖性状，这为阐明动物高繁殖力优良性状形成机理提供了大量的研究基础，将有助于高繁殖力新品种家畜的育成，进而提高畜牧业的经济效益。