单细胞测序技术在心肌炎中的研究进展

郭凯印 韩 波，2

1.山东大学齐鲁医学院， 山东 济南 250012；2.山东第一医科大学附属省立医院儿科，山东 济南 250021

心肌炎是由感染、免疫及中毒等因素引起的心肌组织炎症，其临床表现复杂多变，缺乏特异性，轻者无症状，重者可以导致心力衰竭、心源性休克、恶性心律失常甚至猝死［1］。目前，尚无特异性诊断标志物来指导心肌炎的诊断，心内膜心肌组织活检是诊断心肌炎的“金标准”，但由于其有创、敏感性低，无法广泛应用于临床［2］。心肌炎的治疗主要以对症支持治疗和并发症治疗为主，发病机制尚未完全阐明，目前仍缺乏系统、明确的免疫机制以指导临床诊断及治疗。 单细胞测序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq）技术是指在单个细胞的层面上，对相关组学行高通量测序分析的新技术。其步骤可概括为单细胞的分离、mRNA 反转录、cDNA扩增、构建测序文库、高通量测序及数据分析几个部分。在此之前，人们对于相关组学的传统研究方法是细胞群体中提取遗传信息，得到只能反映这一细胞群体平均差异的信息，而忽略掉很多低丰度但同样重要的信息，同时忽略了细胞独有的特性以及细胞间异质性等问题。单细胞测序的基于可以揭示单个细胞基因表达变化的特性［3］，使其在鉴定新细胞类型、绘制细胞发育及分化轨迹，探索细胞群体协作关系及预测基因调控机制等方面显示出巨大的优势，目前已被广泛用于揭示不同疾病的免疫特征［4-6］。综上所述，以单细胞为分辨率可以协助了解心肌炎进程中相关的细胞簇，对探讨心肌炎的病因与发病机制、寻找新的免疫治疗靶点、提升心肌炎的诊治水平意义重大。现就scRNA-seq技术以及近年来其在心肌炎中的研究进展进行综述。

1 scRNA-seq技术的发展

2009 年，Tang 等［7］发表了首篇关于scRNA-seq的文章，在单个细胞层面上实现了基因测序，此后，更多快捷、灵敏、高通量的测序方法被开发出来。2012年，美国和瑞典的科学家共同开发的Smart-Seq（Switching mechanism at 5' end of the RNA transcript）技术［8］问世，完善了转录本的序列覆盖。2015 年，Macosko 等［9］提出的可以实现自动化分选细胞的方法Drop-Seq，标志着单细胞转录组测序步入高通量时代。后来，基于微流控技术与多细胞分离技术，10x Genomics和华大智造等公司相继推出高通量测序平台，实现了单细胞测序的商业化与标准化。2019 年开发出的基于单细胞测序的空间转录组技术［10］，协助确定疾病中各细胞位置信息，开启了人们更好理解疾病进程中异质性细胞间基因表达及协调配合的空间之门。现在，传统的单细胞转录组学以及基因组学研究已经日趋成熟，并逐渐向着多组学（如蛋白质组学、代谢组学、表观遗传学等）联合研究的方向发展［11］，同时，单细胞相关的测序数据库也在不断更新、整合，为人类探索疾病的发病机制、寻找特异性诊断标志物、聚焦免疫治疗靶点拓展了新的视野。

2 scRNA-seq技术在心肌炎中的研究进展

2.1 scRNA-seq 技术在病毒性心肌炎（viral myocarditis， VMC）中的研究进展

VMC是感染性心肌炎最常见的类型，其中柯萨奇病毒B 组3 型（coxsackievirus group B type3，CVB3）是引起VMC 的一类重要的病原体［12］，以CVB3诱导小鼠建立的VMC模型在世界范围内为公认的稳定的实验动物模型，是研究该疾病发病机制的重要手段。Lasrado等［13］通过对A/J小鼠使用腹腔注射CVB3病毒液的方法来构造VMC 模型，对来自健康小鼠和心肌炎小鼠的心脏组织的共计22 985个细胞进行单细胞测序，共鉴定出26个不同的免疫细胞簇。通过比较细胞类型的相对比例，发现髓系细胞、T细胞和成纤维细胞在心肌炎组中显著富集。对显著富集的细胞类型进行转录组分析、GO 富集分析及qPCR 验证，发现在M2 型巨噬细胞中基因Ccl24、Gatm和Chil3表达上调，提示在抗炎功能和组织纤维化及组织修复中发挥作用［14］。T细胞中的Th17细胞、细胞毒性T淋巴细胞和Treg细胞占比最高，且在Treg 细胞中检测到Nkg7基因过表达，提示心肌炎中的Treg 细胞可能具有细胞毒性这一关键特征［15］，而成纤维细胞作为异质表达基因，则在炎症和免疫反应的调节及心肌纤维化中发挥重要作用。最后，通过配体-受体相互作用确定了66 条信号通路来构建细胞间通讯的网络，揭示了M2 型巨噬细胞、T 细胞和成纤维细胞协同或独立参与VMC发病的可能机制，为鉴定与心肌炎炎症反应相关的基因及免疫治疗方面提供了新的资料。

2.2 scRNA-seq 在自身免疫性心肌炎（autoimmune myocarditis， EAM）中的研究进展

自身免疫介导的免疫反应在心肌炎发病进程中至关重要［16］，目前，研究中最常用的是使用猪心肌球蛋白和完全弗氏佐剂构建EAM 的动物模型。Hua 等［17］通过给Balb/c 小鼠皮下注射α 肌球蛋白重链肽段的方式诱导产生EAM模型，分别从急性炎症期、亚急性炎症期和肌病期的小鼠心脏组织中通过流式分选得到CD45+细胞并行单细胞测序。测序共得到34 665个免疫细胞，通过聚类分析共发现了26个细胞亚群，其中包括9个巨噬细胞簇、3个中性粒细胞簇、5 个T 淋巴细胞簇、2 个B 淋巴细胞簇、3 个树突状细胞簇、1 个NK 细胞簇、1 个固有淋巴细胞簇、1 个心肌细胞簇和1 个内皮细胞簇。通过分析EAM 不同时期各个细胞亚群中炎症相关基因的表达水平，发现炎症相关的基因在急性炎症期的M2型巨噬细胞和Th17细胞中显著高表达，通过单细胞基因调控网络推断分析显示，Hif1a是心肌炎中M2型巨噬细胞和Th17 细胞共有的差异表达基因，且Hif1a的表达水平与炎症程度相关，使用Hif1a抑制剂（例如PX-478）可以减轻EAM 不同时期的炎症反应。在肿瘤相关的研究中提示，Hif1a可能为细胞缺氧反应的重要调节因素，同时在免疫微环境中调节固有免疫和适应性免疫［18-19］。有研究绘制了EAM不同时期的免疫细胞的动态图谱，分别阐述了各细胞亚群在EAM 不同时期中特异性表达的基因及可能作用的机制，有助于更好地了解EAM全过程的免疫环境，以更精准、全面的方式研究疾病发生、发展过程中的细胞亚型，预测可能的信号转导通路及分子靶点，从而有利于寻找疾病特异性的诊断标志物和推动免疫治疗。

2.3 scRNA-seq 在免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors， ICIs）诱导的心肌炎中的研究进展

ICIs是一种用来激活免疫细胞对抗肿瘤细胞的单克隆抗体。目前，ICIs 主要为阻断细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4， CTLA-4）、程序性细胞死亡蛋白1（programmed death 1， PD-1）或程序性死亡配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的单克隆抗体，由于它们都是T 细胞激活和功能的关键抑制剂［20］，因此不可避免地会引起免疫副作用，心肌炎便是一种罕见但死亡率高的并发症［21］。Zhu等［22］对来自ICIs 相关心肌炎患者及健康对照的外周血单个核细胞进行飞行时间质谱、流式细胞术及多组学单细胞技术分析，构建PD-1 缺失的相关小鼠模型，并对从小鼠血液和心脏分离的免疫细胞进行scRNA-seq、TCR-seq、CITE-seq 检测后发现， ICIs 相关心肌炎患者血液细胞毒性Temra CD8+细胞显著增加，与PD-1缺失的小鼠血液和心脏组织中效应性细胞毒性CD8+细胞的增加相对应。通过分析Temra CD8+细胞的转录组信息，发现这些扩增的效应CD8+细胞具有特异的转录变化，包括趋化因子CCL5/CCL4/CCL4L2 的上调，这些结论为ICIs 相关心肌炎患者的诊断及治疗提供了靶点，对减少ICIs治疗的患者发生致命性心脏免疫相关不良事件有重要意义。

2.4 scRNA-seq在COVID-19相关的心肌炎中的研究进展

在世界范围流行的COVID-19对人类心脏的炎症损伤是不可忽视的，约30%感染者被观察到心脏损伤［23］，其发病机制可能与心肌细胞的直接损伤、全身炎症反应、缺氧、血栓前和促凝血状态、心肌间质纤维化、干扰素介导的免疫反应和冠状动脉斑块不稳定性等因素有关［24］。而在儿童群体中，COVID-19 感染数周后可能会引起儿童多系统炎症综合征（multisystem inflammatory syndrome inchildren，MISC）从而导致心肌炎［25］， MIS-C 的临床表现不典型，与川崎病相重叠［25］，MIS-C诊断时间 ≥ 6 d为心源性休克的独立危险因素［26］，因此，早期诊断至关重要。Cevins 等［27］通过收集MIS-C 患儿的外周血，结合细胞因子检测、深度表征免疫细胞和对外周血单个核细胞进行单细胞水平的转录组学分析，鉴定出25个可以将伴有严重心肌炎的MIS-C患儿与其他MIS-C患儿区分开来的单核细胞和树突状细胞基因。这25个基因中的大多数功能与炎症、氧化应激、TNF-α和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号的传导有关。分析分子机制表明，在患有严重心肌炎的MIS-C 患儿的单核细胞和树突状细胞中，属于TNF-α 和NF-κB 信号通路的基因上调，还检测到NF-κB 复合物抑制的低表达，提示心肌炎可能与TNF-α 和NF-κB 信号轴的过度激活有关。Vella等［28］使用流式细胞术对患有MIS-C的儿科患者的外周血单核细胞进行了检测，并将其与患有严重COVID-19的成人进行了比较，结果发现MIS-C的激活特征与患有中度至重度COVID-19疾病的成年人免疫学特征相似。

3 小结与展望

综上所述，scRNA-seq 可以表征心肌炎过程中的细胞多样性和异质性，构建心肌炎各个时期的免疫细胞网络，协助剖析疾病的复杂机制，从而对发现新型诊断标志物、寻找免疫治疗靶点等方面提出建设性意见。但目前关于scRNA-seq技术与心肌炎的研究仍有以下局限性：①scRNA-seq 技术最好应用于新鲜样本，尽管有研究显示，临床的冻存样品也可以进行单细胞核测序（single-nucleus RNA sequencing， snRNA-seq）技术分析来弥补scRNAseq 技术的局限性［29］，但该技术会丢失细胞质中的转录组信息，使测序结果出现偏差。②心肌炎患者的临床新鲜组织获取困难，所以目前大多数基础实验使用的是动物模型，目前常用的为CVB3 病毒构建的VMC模型及猪心肌球蛋白诱导构建的EAM模型，但心肌炎的病因多种多样，与之相对应的许多动物模型尚未建立完善，因此尚不清楚不同病因间基因的表达和免疫细胞功能存在的差异，但随着人类细胞图谱（human cell atlas， HCA）计划的开展［30］，未来将会有更多患者的单细胞测序数据被上传到公共数据平台，为人类更全面研究心肌炎的免疫进程提供参考依据。③心肌炎单细胞测序的公共数据仍亟需深度挖掘。随着心肌炎相关的单细胞测序数据在公共数据库中的不断积累，疾病进程中的免疫网络及调节通路也被逐条梳理，但单细胞测序的海量数据中仍然隐藏着许多未被发掘的信息，近期Gong 等［31］通过分析公共数据中心肌炎小鼠的RNA-seq 和阵列表达谱数据来挖掘差异表达基因（differentially expressed genes， DEG），然后分析DEG与免疫细胞浸润之间的相关性，获得了心肌炎中小鼠的免疫细胞景观，阐明了树突状细胞（dendritic cells， DC）浸润及其相关的关键基因可能是心肌炎进展的原因。该研究从GEO 数据库中获得数据集GSE35182 和GSE53607，对合并的基因表达进行DEG分析和PPI网络构建，从Illumina HiSeq 4000 平台获取scRNA-seq 数据集GSE174458，通过ImmuCellAI 数据库获取心肌炎中免疫细胞的浸润和各免疫细胞的丰度。由此可见，随着心肌炎单细胞测序数据的逐渐完善，生物信息学必将大放异彩，多角度、多组学联合分析的策略也将为了解心肌炎的疾病进展带来更广阔的视野。

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