LncRNA H19的表达异常影响垂体腺瘤的细胞表型

王洋洋 宋兆鹏 曾成龙 宋 涛

1. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）研究生部，山东 济南 250117；2. 山东第一医科大学附属山东省立医院神经外科，山东 济南 250021

垂体腺瘤（pituitary adenoma， PA）是一种常见的神经内分泌肿瘤，起源于鞍内的垂体细胞，一般呈良性，约占颅内肿瘤的10% ~ 15%［1］。大多数PA生长缓慢并局限，但30% ~ 40%的PA 呈侵袭性生长［2］。研究表明，垂体肿瘤在组织学上多为良性，但其生物学特征往往表现为恶性。侵袭性PA常向周围组织侵袭生长，压迫相关的神经血管，引起一系列难以治愈的并发症，严重影响患者生存质量［3］。研究表明，侵袭性PA 的术后残留及肿瘤复发远高于非侵袭性垂体瘤，且复发性PA 治疗难度远高于初次手术治疗［4］。因此，研究PA 的发病机制，寻找诊断和治疗PA的新分子靶点，对提高PA的早期诊断和治疗，提高治愈率具有重要的临床意义。

长链非编码RNA（long non ‐ coding RNA,LncRNA）是一种缺乏编码蛋白质能力的RNA［5］。LncRNA 参与许多不同的生理过程，其异常表达或功能异常与多种疾病尤其是肿瘤的发生发展密切相关［6］。探索LncRNA 在肿瘤中的作用机制和调控途径，可以提高对癌症的认识，并有助于寻找治疗PA的新方法。

H19 是一种与多种癌症相关的典型LncRNA。其基因位于人类11号染色体pl5.5上，长2.3 kb，由5 个外显子和4 个内含子组成［7］。基于H19 抑制肿瘤发生的能力，H19最初被认为具有抑癌特性，但最近的研究表明，H19 同时具有促进肿瘤与抑制肿瘤的双向功能［8］。研究表明，LncRNA H19在正常成人组织中很少表达或不表达，但在多种人类发病的肿瘤中存在不同程度的异常表达。 LncRNA H19参与了癌细胞的发生发展，包括PA［9］。Zhang 等［10］通过动物实验发现，外泌体传递的LncRNA H19 可抑制PA 的生长。Wu 等［11］发现LncRNA H19 可以通过miRNA-93a/ATG7 轴调节，协同多巴胺激动剂治疗泌乳素型垂体瘤。然而，对H19 调控PA 的具体分子机制的研究较少。本研究探索H19在PA中的表达情况及作用，为PA 的诊断和治疗提供了潜在的靶点。

1 材料和方法

1.1 标本组织来源

标本来源于2020年9月至2021年12月山东省立医院神经外科一病区行手术治疗且术后石蜡病理诊断为PA 患者的垂体腺瘤组织及邻近正常组织，列入标本的患者术前均未接受化疗或放疗。标本获取后，立即保存在液氮中，并存放在-80 ℃冰箱中。标本共计获取47 例，其中在不损伤患者情况下，获取瘤周正常组织25 例，标本获取前详细告知患者及家属，并由患者及家属签署知情同意书。本研究经我院临床研究伦理委员会批准。

1.2 细胞培养

将购自于中国科学院细胞库的PA 细胞系HP75种植于Eagle培养基（美国Gibco 公司）并置于恒温培养箱中培养。培养基中含有10%胎牛血清（美国Hyclone 公司）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 mg/mL，美国Sigma公司）。恒温培养箱培养设置条件为37 ℃ ，5% CO2。取对数生长期的HP75细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化传代后接种于24孔板中待用。

1.3 细胞转染

将100 μL无血清完全培养基与H19高表达重组质粒（中国安徽通用生物公司）和脂质体3 000（美国ThermoFisher公司）转染试剂混合，孵育10 min，然后将其滴加入已接种PA 细胞系的24 孔板中，浓度为80%。48 h后，收集细胞用于后续检测。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应

用TRIzol 试剂从组织或细胞中提取总RNA，用PrimeScriptRTM混逆转录试剂盒（takara）逆转录，构建cDNA文库。采用BeyoFast™探针qPCR Mix（中国上海Beyotime 生物技术公司）进行实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real‐time PCR， qRT‐PCR）。PCR 预设条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 60 s，40个循环。其中引物为 H19 forward： 5’TGCTGCACTTTACAACCACT G3’， H19 reverse： 5’ATGGTGTCTTTGATGTTGGG C3’，GAPDH forward：5’GGAGCGAGATCCCTCCA AAAT 3’，GAPDH reverse： 5’GGCTGTTGTCATACT TCTCATGG 3’。均由安徽通用生物股份有限公司合成。分别对垂体腺瘤组织及其对照组瘤周正常组织、转染H19的HP75 细胞系（oe-H19）及其对照组H75 细胞系（oenc）行qRT‐PCR检测。

1.5 CCK-8法检测

将oe-H19 组与oe-nc 组HP75 细胞分别以每孔1 × 104个的密度接种至96孔板中，在培养的24、48、72 和96 h 加入10 μL CCK-8 溶液，继续培养2 h 后，置于酶标仪中，以450 nm 波长测定其吸光值，并分别以空白孔加入等量培养基及CCK-8溶液为参照，检测其生长活性。

1.6 流式细胞测定

将生长良好的oe-H19 与oe-nc 组细胞，分别以每孔1 × 104个的密度接种至6 孔板中，并恒温培养箱中过夜，设置培养条件为37 ℃、5% CO2浓度。离心去除培养液，洗涤并调整细胞浓度，将沉淀的细胞与Annexin V-PE 凋亡检测试剂（中国南京）500 μL充分混匀，孵育20 min，随后使用FacsARIA Ⅲ流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司）分析细胞周期分布数据。

1.7 Transwell小室实验

细胞迁移实验：分别收集培育良好的oe-H19组与oe-nc组HP75细胞，经离心、重悬并分散后，接种于有Transwell小室的24孔板（中国上海）的上室中，并在上室中加入无血清培养液，同时在下室中加入完全培养基；随后放置于恒温箱中培养24 h，培养条件设置为37 ℃、5% CO2；然后用棉签充分擦拭小室膜的上表面，对于下表面，先用4%多聚甲醛固定10 min，然后0.5%结晶紫染色20 min，最后，用自来水冲洗小室膜，在倒置显微镜下观察细胞并计数。再行侵袭实验：先取100 μL 混合好的基质胶（美国BD公司）均匀平铺于Transwell 上室底面，然后放置于恒温培养箱中孵育3 h，随后操作同迁移实验。以上实验每组重复3次。

1.8 统计学分析

采用SPSS 26.0进行统计分析。本研究数据均源于oe-H19组与oe-nc组计量资料，应用夏皮洛-威尔克法对资料分别进行正态性检验，显著性均>0.05。正态分布数据用均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验，方差不齐时采用t'检验。检验水准α= 0.05。

2 结 果

2.1 PA中H19的表达异常

qRT-PCR检测结果显示，PA组织中H19的表达量低于正常垂体组织（表1），差异具有统计学意义（P＜ 0.001）。

表1 H19在PA组织与正常组织中的表达

2.2 H19过表达影响体外PA细胞的细胞表型

采用qRT-PCR检测高表达H19的PA细胞系的转染效率（表2），oe-H19 组H19 表达量高于oe-nc组，差异具有统计学意义（P＜ 0.001）。

表2 H19在转染的H75细胞中表达上调

用CCK-8 来检测高表达H19 对PA 细胞增殖的影响，转染后的HP75细胞活力明显降低，取培养96 h的2组数据，oe-nc组吸光值高于oe-H19组，差异具有统计学意义（P＜ 0.001）。详见表3。

表3 高表达H19对PA细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响

采用流式细胞检测评价高表达H19对PA 细胞凋亡的影响， oe-H19 组凋亡细胞率明显高于oe-nc组，差异具有统计学意义（P＜ 0.001）。详见表3。

通过transwell 小室研究H19 过表达对PA 细胞迁移和侵袭的影响。实验发现oe-nc 组transwell 小室膜下表面细胞数明显多于oe-H19组，差异具有统计学意义（P＜ 0.001）。详见表3。

3 讨 论

PA是常见的中枢神经系统肿瘤之一，其发病率和预后不良程度逐年增加［12］。中枢神经系统疾病往往受其精密复杂的结构和功能影响，其诊断和治疗一直以来都是临床难点［13］。靶向分子治疗作为近年来新兴的治疗方法，在多种疾病（包括肿瘤）中发挥了重要作用［14］。LncRNA 对PA 的调控作用近年来已被大量报道。例如，LncRNA LINC01116 通过调节miR-744-5p/HOXB8 通路来促进PA 的进展［15］；LncRNA LINC00473 通过介导miR-502-3p/KMT5A轴，参与PA细胞的发育［16］。研究表明，LncRNA H19的异常表达在神经胶质瘤［17］、颅内动脉瘤［18］、神经母细胞瘤［19］等肿瘤的发生发展中起着重要作用。同时，LncRNA H19 的异常表达也通过调控通路的关键酶基因，参与中枢神经系统疾病的发病机制［20］。这表明LncRNA H19可以成为中枢神经系统肿瘤的一个很有前途的治疗靶点和生物标志物。本研究发现， LncRNA H19 在PA 中的表达水平较低，这与之前的报道相同［10］。通过细胞转染、流式细胞测定、CCK-8等方法，证实H19的过表达影响了PA细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等细胞表型，这揭示了H19在PA 的发生发展中的作用。本研究探索了LncRNA H19作为PA靶向治疗部位的可能性，为PA的治疗提供了新的方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突