植物来源牙本质交联剂的研究进展

柏婷婷 孙广迪 陈 雪 魏 飞 朱 松

近年随着树脂-牙本质粘接技术发展，在牙体缺损修复方面取得了良好的临床效果，但在牙本质粘接耐久性方面仍存在不足。牙本质是由70%羟基磷灰石、20%有机成分以及10%血清样液体组成，有机成分里90%为胶原，主要为I 型胶原。酸蚀后脱矿的牙本质表面呈现为疏松多孔的胶原网状结构，理想条件下酸蚀-冲洗类的粘接剂的挥发性溶剂携带水分挥发，有利于疏水性粘接剂单体渗入并充满胶原网的微间隙，从而在树脂-牙本质粘接界面形成均匀的混合层（hybrid layer，HL），但因树脂单体在脱矿牙本质胶原内渗透渐进性的特点，渗透深度无法到达酸蚀的深度，造成混合层底部的胶原纤维暴露，在水及酸蚀作用下激活基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）和半胱氨酸组织蛋白酶（cysteine cathepsins，CC），造成暴露的胶原降解，逐步破坏粘接界面导致粘接失败。对自酸蚀类粘接剂而言，自酸蚀粘接剂的亲水性酸性粘接单体，仅溶解部分玷污层，使玷污层成为混合层的一部分。但因自酸蚀粘接系统去除了冲洗步骤，自酸蚀粘接剂与牙齿硬组织作用所形成的可溶性的磷酸钙滞留于牙本质混合层中，在水充分的环境中，可溶性钙盐不稳定，破坏牙本质粘接界面的完整性，从而影响粘接的耐久性。目前植物来源的交联剂可以通过促胶原交联改善牙本质粘接的耐久性。本文对植物来源牙本质交联剂的作用机制以及在其基础上添加不同成分的复合应用进行综述，以期为改善牙本质粘接性能提供依据。

一、多酚类植物交联剂

1.原花青素

原花青素(procyanidin，PACs)是植物中广泛存在的一种多酚类化合物，多见于葡萄籽提取物（GSE），因其所含的羟基与邻苯二羟基结构，使PACs 在清除自由基、螯合金属离子、清除活性氧等方面有显著作用。PACs 的高度羟基化结构可与蛋白质形成不溶性复合物，稳定增加I 型胶原纤维的交联[1]。此外，PACs 结构中的羟基可与胶原纤维形成氢键，并通过芳香环的疏水作用达到稳定胶原蛋白的作用中[2，3]，氢键是促胶原蛋白中的酰胺羰基和酚羟基外源性交联的主要力量[1，4]，除此之外，研究证明PACs 与胶原交联后周围氨基酸残基与胶原三螺旋结构的分离可能会隐藏MMPs 的裂解位点，从而抑制MMPs的活性，保护暴露的胶原[5]。

（1）PACs与粘接剂的复合应用

研究表明将6.5% 的GSE 作为通用粘接剂single bond 自酸蚀模式的预处理剂涂布脱矿牙本质，可通过提高脱矿牙本质的机械性能提升即刻和老化后的粘接强度，从而增加树脂-牙本质粘接的耐久性[6]。这与Jowkar 等[7]用GSE 作为龋坏牙本质的预处理剂后得出的实验结果具有一致性。在酸蚀-冲洗类实验粘接剂中加入1.5～2% GSE 的结果表明，粘接剂在显微硬度和弹性模量方面存在负面影响。这是由于GSE在参与自由基聚合时向自由基提供氢原子，从而干扰了自由基聚合[8]。同样，在实验粘接剂中加入5～10%的PACs 后，粘接剂的转化率有所降低，未聚合的粘接单体会产生塑化效应，而且更容易被降解，这两种情况都会造成混合层的破坏[9]。

由此可知，PACs 作为预处理剂时，通过PACs 与胶原的相互作用可促进胶原交联及减缓树脂-牙本质粘接界面的退化；而浓度较高的PACs直接掺入粘接剂中会影响粘接剂双键的转化率，导致混合层结构不稳定，纳米渗漏增加，粘接强度降低[10]。

（2）PACs与酸蚀剂的复合应用

研究人员用2% GSE 分别与5%、10%及20%磷酸进行混合[11]，对照组（37%磷酸）和20%磷酸组的即刻微拉伸强度（μTBS）较高，但随时间推移粘接强度下降显著，而老化后，5%和10%磷酸组的μTBS相对稳定。原因在于20%磷酸组的pH 较低，酸蚀牙本质的速度快于GSE 的扩散速率，部分脱矿的胶原纤维未得到充分保护，随时间推移这些胶原纤维被酶降解，最终引起粘接强度的下降[12]。这与De-Paula 等[13]的实验结果相一致，PACs 加入到37%的磷酸会导致老化后粘接强度大幅度的降低。值得关注的是经GSE-磷酸改性后的牙本质在AFM 图像观察到胶原纤维与GSE 交联并形成更大的球状结构，此种纤维结构发生变化可表明存在潜在的再矿化[11]，有待后续更深入地研究。

综上所述，在PACs的选择上，应注意PACs的浓度，使其既可促进牙本质胶原交联，又不会对粘接剂的转化率造成负面影响，从而保持树脂-牙本质粘接界面的稳定性[14]。

2.表没食子儿茶素没食子酸酯

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）是绿茶中的一种多酚类物质。EGCG通过氢键与胶原蛋白交联，可以改善胶原蛋白的机械性能[15]，抑制MMP-2 和MMP-9 的明胶分解活性[16]。EGCG 可与激活MMPs 的锌离子螯合，从而抑制MMPs 的识别能力进而抑制胶原降解[17]。此外，多酚类物质可以减少酸性化合物的产生，降低链球菌在葡萄糖基转移酶的作用下合成附着性不溶性葡聚糖的能力[18]，故EGCG还具有良好的抗菌性能。

（1）EGCG与粘接剂的复合应用

研究证明0.5%的EGCG 掺入酸蚀-冲洗粘接剂后可显著提升老化后牙本质的粘接强度[19]。另有学者分别将0.1% EGCG和2%氯已定作为自酸蚀粘接剂(Clearfil SE Bond)的预处理剂涂布脱矿牙本质表面60 s 后发现[20]，相对氯已定而言，EGCG 对健康牙本质和龋坏牙本质均未出现负面作用，原因为EGCG 的羟基对健康及龋损的牙本质胶原蛋白表现出更大的亲和力，与牙本质形成更稳定的结合，因而经EGCG 处理后牙本质粘接强度更高。除此之外，针对EGCG 对龋坏牙本质的研究中，Czech 等[21]将EGCG 作为预处理剂处理龋坏牙本质的实验中发现，与对照组相比，EGCG 处理后可以提高龋坏牙本质即刻和老化后的树脂-牙本质界面粘接强度。

另一项研究使用负载EGCG 的聚合物微粒掺入single bond 2的研究中发现。实验组不仅不影响粘接剂的转化率，还显著提高了老化后的粘接强度[22]。相对于游离的EGCG，使用EGCG聚合物微粒可以保护药物免受降解，因而避免药物活性的降低。由聚合物（如：聚乳酸-羟基乙酸）产生的微粒可将其应用在向牙本质小管递送负载药物的纳米颗粒，这也是一种可以应用于修复体的新型治疗策略。

二、光引发类植物交联剂

核糖黄素（riboflavin, RF）早已经成功地应用于眼科领域[23]。此前研究表明，在牙本质粘接剂中加入经紫外光激发的RF 能够改善脱矿牙本质的机械性能，并提高即刻粘接强度[24]。其作用机制为通过吸收波长为446、375、265 和220 nm 处的蓝光（Blue Light，BL）和紫外光（Ultraviolet Radiation A，UVA），使RF生成激发态或变成三重态产生活性氧自由基，这些氧自由基通过诱导肽链上甘氨酸的氨基与相邻肽链上羟脯氨酸或脯氨酸的羰基形成共价键[25]。光敏RF作为预处理剂处理脱矿牙本质的实验中，显微拉曼光谱显示酰胺-I 和酰胺-III 处的振动，表明胶原网络结构的变化从而证明RF 与胶原蛋白的有效交联[26]。

1.RF与粘接剂的复合应用

Daood 等[27]在酸蚀-冲洗粘接剂中加入不同浓度的RF，得出结论1%RF 组对粘接强度无统计学差异，且与对照组相比，RF 加入后MMPs 的活性降低了2～13 倍。但随粘接剂中RF 浓度的增加引起了粘接强度下降，这是由于RF中赖氨酸和精氨酸交联形成的戊糖苷在牙本质胶原中的积累过多影响了粘接剂的转化率，导致老化后粘接强度下降。在一项后续的研究中将壳聚糖和RF以不同比例加入酸蚀-冲洗粘接剂中，在壳聚糖：RF 成分比为1:3 和1:4 时，SEM 图像中可见胶原纤维网络较为完整，且老化3年后粘接强度较对照组显著提高[28]。壳聚糖作为一种亲水性聚合物，含有与活性分子交联形成化学键的羟基和氨基，可改善胶原蛋白的抗降解能力[29]。因此，在粘接剂中添加RF 和壳聚，也是可以提升胶牙本质力学性能的一种方法。

有学者对于含3wt%的RF 水溶液作为Clear Fil SE Bond 2 底涂剂前的预处理剂与直接将3wt%的RF 溶于Clear Fil SE Bond 2 底涂剂进行了比较。该研究发现，随时间推移，RF 作为预处理的粘接强度均优于将其混入底涂剂中[30]，其原因为自酸蚀粘接剂中的底涂剂的主要成分为酸性粘接性单体、挥发性溶剂以及光敏引发剂，此类底涂剂pH 较低。RF 的光解与pH 之间存在高度相关性，光敏RF在碱性溶液中反应活性增加[31]，因此RF预处理组促进胶原交联的效果更佳。

2.RF与其他成分的复合应用

Abunawareg 等[32]分别用BL 和UVA 激活的核黄素-5-磷酸钠盐水合物（R-5-PO4）作为预处理剂处理牙本质表面，24 小时后的即刻粘接强度无明显差异。经过12 个月的水浸泡，RB/BL 组虽然效率低于RF/UVA 组，但与对照组相比，BL/RF 在改善力学性能、粘接强度、保护牙本质混合层等方面仍表现良好。虽然UVA 组的实验效果更好，但是BL 可更好的穿透牙本质，且在临床操作中更加方便。

除光敏RF 之外，有学者将渗透促进剂-维生素E-TPGS（VE-TPGS）和RF 加入自酸蚀粘接剂中[23]，TEM 图像中可见胶原纤维结构完整，VE-TPGS 促进RF 的渗透，在蛋白质水平上保持了N 端和C 端的端肽结构域完整，从而保护暴露的胶原纤维并提高胶原交联水平，并显著抑制MMPs 的活性，利于提升粘接耐久性。目前，RF因无细胞毒性更适宜在临床中使用，针对其他方式促RF交联仍待深入研究。

三、小结与展望

目前植物来源牙本质交联剂的复合应用效果包括：改善牙本质的生物学特性；抑制未受保护的胶原纤维的降解；增加树脂-牙本质界面的粘接强度；有些交联剂还可增加抗菌性或减少混合层的降解。然而，这些交联剂也有各自的局限性，如PACs 在不同的粘接体系中，交联剂的的添加方式及浓度仍待进一步探究；其次，紫外光源在实验中应用于牙本质交联剂的安全性和临床实用性也存在争议。上述问题也为下一阶段的研究设计提供了新的思路。总体而言，目前研究交联剂的实验多为体外实验，观察时间超过两年的较少；此外，胶原蛋白交联对牙髓细胞的影响尚不清楚。随着今后相关实验的深入研究，将开发出功能更好、操作更简单的牙本质交联剂的复合应用。