秀珍菇多肽的制备及其抗氧化活性

武少兰, 张芳艺, 罗小芳, 李昕霖, 吴敏文, 郑舒桓, 杨成龙, 江玉姬

(1.福建农林大学食品科学学院,福建 福州 350002;2.福建省食用菌技术推广总站,福建 福州 350003;3.福州市农业局,福建 福州350025;4.福建省农业科学院农业工程技术研究所,福建 福州 350001)

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)又称小平菇和姬菇,在我国福建、广东、山西、黑龙江和吉林等省份大量栽培[1-2].秀珍菇外形美观、营养丰富、口感柔和、香味浓郁[3],富含蛋白质和多糖, 还含有黄酮、多酚和多种微量元素[4],具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节作用[2].吕建敏等[5]研究表明,秀珍菇对H22荷瘤小鼠模型肿瘤抑制率达到48.80%;Song et al[6-7]研究表明,秀珍菇菌丝体多糖对大鼠急性酒精性肝损伤具有降低脂质堆积和炎症因子的作用.目前,秀珍菇主要是新鲜销售,品种单一,产业链短,需要开发深加工产品.秀珍菇含有大量的蛋白质,约占干菇的30%,然而一直以来的研究对象主要是秀珍菇多糖,对秀珍菇蛋白质的研究很少.

多肽作为一种生物活性物质,具有抗氧化、消炎、降血糖、抑菌和抗肿瘤的作用[8-9],目前,香菇、杏鲍菇、蛹虫草和竹荪等食用菌中的多肽及其抗氧化性已有报道[10-11],但秀珍菇多肽还没有相关的报道.据此,本研究先提取秀珍菇的蛋白质,再通过酶解蛋白质制备多肽,并测定多肽的抗氧化能力,旨在为研究秀珍菇多肽的生理功能,开发秀珍菇的深加工产品,拓展秀珍菇的产业链提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料 新鲜秀珍菇购于福建省漳州市新发生物科技有限公司.

1.1.2 试剂 超低分子质量(3.3～20.1 ku)预染蛋白质Marker购于北京Solarbio公司;LabPAGE预制胶(20%)购于北京兰博利德商贸公司;碱性蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶购于上海源叶生物有限公司;甲醇、冰乙酸、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、过硫酸钾、邻苯三酚、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸(TCA)等购于国药集团.

1.1.3 仪器设备 主要仪器设备有L-8900氨基酸自动分析仪[天美(中国)科学仪器有限公司]、R205旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)、DL-5-B离心机(厦门精艺兴业科技有限公司)、LGJ-12真空冷冻干燥机(北京松源有限公司)、DYY-12C电泳仪(北京六一仪器厂)、SpectraMaxi 3X功能酶标仪(美国Molecular Devices公司).

1.2 秀珍菇蛋白质的提取

秀珍菇于50 ℃恒温烘干粉碎后过60目筛.称取一定量的秀珍菇粉末放入烧杯中,按照1∶40(g∶mL)的料液比加入蒸馏水并用1 mol·L-1NaOH调节pH至11,于55 ℃水浴提取4 h后,再于4 500 r·min-1离心10 min.取上清液,用1 mol·L-1HCl调节pH至5.8,于冰箱放置12 h,再于4 500 r·min-1离心10 min.收集蛋白质沉淀,冷冻干燥后即为秀珍菇蛋白质,经过考马斯亮蓝测得提取的蛋白质质量分数为674 mg·g-1.

1.3 秀珍菇多肽制备流程

1.4 秀珍菇多肽最佳酶解工艺参数的确定

1.4.1 单因素试验 蛋白质在酶解的过程中受料液比、酶的种类、酶浓度、时间、温度和pH等因素的影响[12].因此,考察酶的种类(复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶)、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)]、酶浓度(2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U·g-1)、时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、温度(45、50、55、60、65、70 ℃)和pH(8、9、10、11、12、13)对秀珍菇多肽得率的影响,分别进行单因素试验,以确定最佳的因素水平.

1.4.2 正交试验 在单因素试验的基础上,以pH、酶浓度、温度、时间4个因素为自变量,以多肽得率为指标,筛选最佳的提取条件.设计的5因素4水平正交试验如表1所示.

表1 正交试验因素水平表

1.5 秀珍菇多肽得率的测定

采用双缩脲法测定,参考周燕芳等[13]的方法配制双缩脲试剂.准确称取10 g酪蛋白,用蒸馏水配制质量浓度为10 mg·mL-1的母液.取7个试管,分别吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL酪蛋白母液,加水至1 mL,摇匀,每管再加入4 mL双缩脲试剂充分混合,于室温下放置30 min,再于540 nm波长处检测各样品的光密度(D).以多肽含量为x轴,D540 nm为y轴,绘制的标准曲线方程为:y=0.047 9x+0.070 1(R2=0.999).

制备好的秀珍菇多肽液以1∶1的体积比加入质量分数为15%的TCA,充分混匀静置30 min后,于5 000 r·min-1离心10 min.取1 mL上清液,加入4 mL双缩脲试剂混匀静置30 min后,在 540 nm波长处测定D值.根据标准曲线方程(y=0.047 9x+0.070 1)计算多肽含量(秀珍菇蛋白质酶解前多肽的质量分数为11.2%).

多肽得率/%=(酶解后的多肽含量×稀释倍数-酶解前的多肽含量×稀释倍数)/总蛋白质含量×100

1.6 秀珍菇多肽指标的测定

1.6.1 抗氧化能力的测定 秀珍菇多肽对DPPH自由基的清除能力按Latorres et al[14]的方法测定,对羟基自由基的清除能力按齐希光等[15]的方法测定,对ABTS+自由基的清除能力按王荣等[16]的方法测定.

自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai为样品溶液的D540 nm,Aj为样品参比溶液的D540 nm,A0为空白溶液的D540 nm.

1.6.2 分子质量的测定 采用SDS-PAGE检测秀珍菇多肽的分子质量.电泳时选择20%预制胶,1 mg·mL-1待测样品用上样缓冲溶液(含100 mg SDS、0.1 mg羟基乙醇、1 mL甘油、2 mg溴酚蓝、0.5 mL磷酸缓冲液,加双蒸水至10 mL)溶解,电泳前沸水浴5 min,离心取上清液.上样量为15 μL,电泳于恒压100 V下进行.用0.25%考马斯亮蓝R-250进行凝胶染色,脱色液中甲醇、冰醋酸、水的体积比为4∶1∶5[17].凝胶染色和脱色后进行拍照.

1.6.3 基本组分和氨基酸组成的测定 秀珍菇多肽中的蛋白质、灰分、水分等基本组分含量及氨基酸组成由福建省农业科学院测试中心测定.

1.7 数据处理

试验数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 秀珍菇蛋白质酶解制备多肽的单因素试验结果

2.1.1 蛋白酶种类和酶解时间对秀珍菇多肽得率的影响 在料液比为1∶30(g∶mL)和酶浓度为6 000 U·g-1的条件下,分别加入复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶,在各自最适的酶解条件下酶解1、2、3、4、5 h,制备秀珍菇多肽,测定多肽得率.由图1可知,采用碱性蛋白酶制备的多肽得率明显高于其他5种酶,且酶解时间为1～2 h时,多肽得率随着酶解时间的增加而增大,但酶解时间继续延长时多肽得率有所减少.采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶制备的多肽得率最低,采用胰蛋白酶、复合蛋白酶和中性蛋白酶制备的多肽得率较低.因碱性蛋白酶酶解1～5 h时制备的多肽得率为53.25%～56.49%,变化幅度较小,故选取0～3 h进行进一步试验.

图1 蛋白酶种类和酶解时间对秀珍菇多肽得率的影响

2.1.2 料液比对秀珍菇多肽得率的影响 以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)的料液比添加6 000 U·g-1碱性蛋白酶,在pH为10、温度为55 ℃的水浴条件下反应2 h,制备秀珍菇多肽,测定多肽得率.由图2A可知,随着料液比的不断增大,多肽得率显著上升,表明底物与酶充分接触,多肽得率增大.料液比为1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)时的多肽得率分别为52.34%、54.47%、55.72%,即料液比高于1∶30(g∶mL)时,随着料液比的增大,多肽得率增加速度变缓,且料液比增大,后续蒸发浓缩难度加大,因此选择1∶30(g∶mL)为最佳料液比.

2.1.3 碱性蛋白酶浓度对秀珍菇多肽得率的影响 由图2B可知,碱性蛋白酶浓度对秀珍菇多肽得率的影响明显.碱性蛋白酶浓度为2 000～6 000 U·g-1时,多肽得率随着蛋白酶浓度的增加而增大;碱性蛋白酶浓度为6 000～8 000 U·g-1时,多肽得率变化不明显;当碱性蛋白酶浓度大于8 000 U·g-1时,多肽得率显著下降.碱性蛋白酶浓度为2 000～6 000 U·g-1时,由于底物充足,蛋白酶含量较少,多肽得率会随着蛋白酶浓度的增加而逐渐增大;当碱性蛋白酶浓度为6 000 U·g-1时,多肽得率最大,达到52.74%;但继续增加蛋白酶浓度时,由于底物不足,多肽得率不再增大[18].因此选择6 000 U·g-1作为最佳碱性蛋白酶浓度.

2.1.4 pH对秀珍菇多肽得率的影响 由图2C可知,随着pH的升高,秀珍菇多肽得率呈先增加后减少的趋势.pH为11时,多肽得率为55.55%,这时蛋白酶的活性较高,多肽得率达到最高点;随着pH进一步加大,蛋白酶会逐渐失去活性.因此选择11为最佳pH.

2.1.5 酶解时间对秀珍菇多肽得率的影响 由图2D可知,随着酶解时间的延长,秀珍菇多肽得率呈先增大后减小的趋势.酶解1.5 h时,多肽得率最大,为58.39%;但随着反应的继续,多肽得率逐渐下降.这可能是随着酶解时间的增加,底物蛋白质被完全酶解,多肽含量不再增大,长时间的浸提甚至会导致一些肽键断裂,从而影响多肽得率[19].因此选择1.5 h为最佳酶解时间.

2.1.6 酶解温度对秀珍菇多肽得率的影响 由图2E可知,在一定的温度范围内,随着酶解温度的升高,秀珍菇多肽得率呈先增大后减小的趋势.当酶解温度为60 ℃时,多肽得率达到最大值,为63.62%;当酶解温度超过60 ℃时,多肽得率呈下降趋势.可见,在酶解过程中,适当升高温度可以提高酶活性,促进蛋白质水解,但温度过高,酶蛋白开始变性,酶解的效率就会下降[20].因此选择60 ℃为最佳酶解温度.

A:料液比;B:碱性蛋白酶浓度;C:pH;D:时间;E:温度[不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)].

2.2 秀珍菇蛋白质酶解制备多肽的正交试验结果

在单因素试验的基础上,料液比恒定为1∶30(g∶mL)的条件下,以多肽得率为指标对秀珍菇蛋白质酶解制备多肽的条件进行优化.正交试验结果(表2)显示,4个因素对秀珍菇多肽得率影响程度为:A>D>C>B,最佳条件组合为A3B3C2D3,即pH 11,碱性蛋白酶浓度6 000 U·g-1,温度55 ℃,时间1.5 h.

表2 正交试验结果

正交试验方差分析结果(表3)显示,pH(A)对秀珍菇多肽得率的影响极显著,酶解时间(D)、酶解温度(C)和碱性蛋白酶浓度(B)对多肽得率的影响显著.采用最佳工艺制备秀珍菇多肽,多肽得率3次测定的平均值为70.96%.

表3 正交试验方差分析结果1)

2.3 秀珍菇多肽的抗氧化能力

2.3.1 对羟基自由基的清除率 羟基是一种非常活跃的自由基,具有很强的侵略性,被认为是最有毒的活性氧自由基,可以对生物造成过氧化破坏[21].从图3A可知,秀珍菇多肽对羟基自由基有很强的清除能力,且与多肽含量呈正相关.当秀珍菇多肽的质量浓度为2.5 mg·mL-1时,对羟基自由基的清除率达到98.84%,略低于同含量VC的清除率,高于采用杏鲍菇柄[22]、蛹虫草[23]和猴头菇[24]制备的多肽对羟基自由基的清除率.

2.3.2 对DPPH自由基的清除率 DPPH自由基是一种脂质自由基的模型化合物,是评估自由基清除活性的关键指标之一[25].从图3B可知,随着秀珍菇多肽含量的增加,对DPPH自由基的清除能力也逐渐增大.当秀珍菇多肽的质量浓度为2.5 mg·mL-1时,对DPPH自由基的清除率达到81.57%,低于同含量VC的清除率,与采用杏鲍菇柄[22]、蛹虫草[23]和猴头菇[24]制备的多肽对DPPH自由基的清除率相当.

2.3.3 对ABTS+自由基的清除率 ABTS+是一种人工合成的自由基,结构更稳定,操作更方便.从图3C可知,秀珍菇多肽的质量浓度为2.5 mg·mL-1时,对ABTS+自由基的清除率达到99.81%,接近同含量VC的清除率,高于采用鲫鱼[26]和鹿角[27]制备的多肽对ABTS+自由基的清除率.

图3 秀珍菇多肽对羟(A)、DPPH(B)和ABTS+(C)自由基的清除率

2.4 秀珍菇多肽的分子质量

SDS-PAGE检测结果(图4)显示,秀珍菇多肽2份样品A1、A2的最大分子质量约为5.8 ku.刘思杉等[28]研究表明,秀珍菇蛋白质的分子质量为32.4～40.3 ku.表明秀珍菇蛋白质经过酶解后,其分子质量降低80%左右.

M:3.3～20.1 ku超低分子质量预染蛋白质Marker;A1、A2:秀珍菇多肽.

2.5 秀珍菇多肽的基本组分及氨基酸组成

采用最佳工艺制备的秀珍菇多肽含74.6%蛋白质、11.8%灰分、8.5%水分、5.1%其他成分.

秀珍菇多肽富含17种氨基酸,其中,天门冬氨酸占比10.46%,苏氨酸占比5.20%,丝氨酸占比4.85%,谷氨酸占比14.51%,甘氨酸占比5.08%,丙氨酸占比6.95%,胱氨酸占比0.70%,缬氨酸占比6.35%,蛋氨酸占比3.02%,异亮氨酸占比5.36%,亮氨酸占比8.39%,酪氨酸占比4.00%,苯丙氨酸占比5.04%,赖氨酸占比7.33%,组氨酸占比2.55%,精氨酸占比6.18%,脯氨酸占比4.03%.秀珍菇多肽包含缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸8种必需氨基酸,必需氨基酸占氨基酸总量的43.24%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为76.18%,符合联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对优质蛋白质的要求.谷氨酸(14.51%)和天门冬氨酸(10.46%)是秀珍菇多肽中最丰富的氨基酸.研究表明:谷氨酸、天门冬氨酸与抗氧化能力呈正相关[29];也是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质,是哺乳动物肠道细胞中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的重要来源,并可以通过脱羧和转氨转化为其他营养物质,在体内发挥作用[30].由此可知秀珍菇多肽的营养价值较高.

3 结论

秀珍菇多肽最佳酶解工艺参数为:pH 11、碱性蛋白酶浓度6 000 U·g-1、温度55 ℃、时间1.5 h;采用最佳酶解工艺制备的秀珍菇多肽得率为70.96%,其分子质量最大,约为5.8 ku;秀珍菇多肽抗氧化能力强,2.5 mg·mL-1多肽对DPPH、ABTS+和羟基自由基的清除率分别达到81.57%、99.81%、98.84%.本研究结果可为后续将秀珍菇多肽开发为功能性食品和药品提供参考.