必需氨基酸调控奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的研究进展

杨 静 邢媛媛 孙 梅 李大彪

(内蒙古农业大学动物科学学院,动物营养与饲料科学自治区高等学校重点实验室,呼和浩特 010018)

牛奶具有特殊的营养特性,是人类饮食中必需营养素的重要来源。乳蛋白作为乳中重要的营养成分,能提供人体所需的必需氨基酸(essential amino acid,EAA),其含量的高低是衡量乳品质的重要指标。乳蛋白的合成和分泌包括乳腺对氨基酸的摄取、乳蛋白相关基因的转录和翻译、翻译后蛋白质的修饰以及最后分泌到乳汁中等一系列复杂的程序[1]。牛奶中90%以上的乳蛋白是由乳腺摄取血液中的游离氨基酸后从头合成的,充足的氨基酸供给和平衡的氨基酸模式是提高乳蛋白合成的关键。然而,生产者为了提高乳蛋白含量,通常在饲粮中添加过量的氨基酸,过度的氨基酸供给不但提高了生产成本,而且造成了环境污染。因此,如何通过营养调控使乳蛋白的合成和氨基酸的利用率达到优化成为当前动物营养学界的研究热点。

国内外学者利用体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)开展了大量关于必需氨基酸(EAA)对乳蛋白合成影响的研究,得出EAA主要通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mechanistic target of rapamycin target protein complex 1,mTORC1)和一般性调控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible 2 kinase,GCN2)2条关键信号通路调控BMECs乳蛋白的合成[2]。mTORC1主要靠感受养分和生长因子含量的波动发挥作用,当氨基酸水平充足时会激活mTORC1信号通路,进而通过mTORC1的磷酸化调控乳蛋白的合成[3]。GCN2主要感受氨基酸缺乏,当细胞内氨基酸不足时,空载tRNA的增加会激活GCN2,进而引起真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)51位点的丝氨酸(Ser)磷酸化,使体内大部分蛋白质的合成降低[4]。本文主要综述了国内外关于蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)、支链氨基酸(branched chain amino acids,BCAAs)、精氨酸(Arg)和EAA平衡模式对BMECs乳蛋白合成的影响及其潜在的信号通路机制,旨在为深入研究BMECs乳蛋白合成机理和提高泌乳奶牛氨基酸转化为乳蛋白的效率提供理论依据。

1 Met对BMECs乳蛋白合成的调控

Met作为含硫氨基酸,是所有动物乳蛋白合成的EAA,也是奶牛的限制性氨基酸之一。有研究报道,当培养基中Met浓度为0.52 mmol/L时可显著提高BMECs中κ-酪蛋白3(CSN3)和αs1-酪蛋白(CSN1S1)的基因表达丰度[5-6]。饲粮中添加适量的Met可以提高奶牛乳蛋白产量[7],牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cell line,MAC-T)中缺乏Met会降低酪蛋白合成率[8]。赵艳丽等[6]研究发现,当培养基中Met浓度为0.78 mmol/L时,CSN1S1和CSN3的基因表达受到抑制。此外,当Met浓度为0.9和1.2 mmol/L时,BMECs中酪蛋白表达下调[9]。这可能是因为过量的Met转化为具有高度细胞毒性的同型半胱氨酸或甲硫基丙醛,进而抑制乳蛋白的合成[10]。

Met可以通过调节BMECs的活力进而影响酪蛋白的合成,提高乳腺上皮细胞的活力在一定程度上可以促进乳蛋白的合成,而乳腺上皮细胞的凋亡则对乳蛋白的合成有一定的抑制作用。Duan等[11]研究发现,当Met浓度为0.6 mmol/L时BMECs的活力最高,同时β-酪蛋白的蛋白表达量达到最大,而当Met浓度为1.2 mmol/L时BMECs活力下降,同时酪蛋白合成受到抑制。

Met除了作为乳蛋白合成的底物外,还可以通过激活乳蛋白合成相关信号通路来调节BMECs中酪蛋白的合成[12]。Jeon等[13]研究发现,0.6 mmol/L Met作用MAC-T 72 h会通过提高mTOR的下游信号分子核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1)的mRNA表达量来促进β-酪蛋白合成。代文婷[14]研究发现,与0.6 mmol/L Met组相比,无Met培养基通过激活GCN2信号通路抑制了BMECs酪蛋白的合成。

此外,Met可以调控氨基酸转运载体(amino acid transporters,ATT)的表达进而影响酪蛋白的合成[11,15]。Qi等[9]研究表明,在培养基中添加0.6 mmol/L Met可通过刺激钠偶联中性氨基酸转运体2(sodium coupled neutral amino acid transporter 2,SNAT2)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路提高BMECs中αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的蛋白表达。另有研究发现,0.6 mmol/L Met可通过提高L型氨基酸转运载体(Ltype amino acid transporter,LAT1)和4F2重链(4F2 heavy chain,4F2hc)的表达进而促进BMECs中β-酪蛋白的合成,4F2hc是LAT1表达必需的一种细胞表面糖蛋白,用于LAT1的功能性表达和二聚体复合物的形成[11]。

2 Lys对BMECs乳蛋白合成的调控

Lys作为一种EAA,是饲喂玉米基础饲粮的奶牛合成乳蛋白的主要限制性氨基酸[16]。BMECs中14C标记的Lys代谢试验表明,90%左右的Lys用于蛋白质合成,4%的Lys氧化生成二氧化碳,6%的Lys可以在乳腺中代谢分解,为非必需氨基酸(nonessential amino acid,NEAA)的生物合成提供氮源[17]。因此,Lys的充足供给是保证乳蛋白产量的必要条件。Awawdeh[7]研究发现,过瘤胃赖氨酸(rumen-protected Lys,RPL)可显著提高荷斯坦奶牛乳蛋白含量。还有研究发现,在培养基中添加1 mmol/L Lys可通过促进BMECs中蛋白质周转进而提高乳蛋白的合成[17]。

除了作为乳蛋白合成的底物,Lys也是影响乳蛋白合成的关键细胞因子,能够通过激活mTOR信号通路调控BMECs乳蛋白合成[18]。高海娜等[19]研究发现,0.5和2.0 mmol/L Lys 显著促进了BMECs中CSN1S1和CSN2的基因表达,同时提高了mTOR信号通路中mTOR和S6K1的基因表达量。此外,有研究表明0.7 mmol/L Lys可以通过调节细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)活性促进细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinases 1,CDK1)的表达,进而激活BMECs中mTOR信号通路促进β-酪蛋白合成[18]。毕微微[20]研究发现,添加100 μg/mL Lys-Lys二肽上调了BMECs内mTOR信号通路中与乳蛋白翻译相关的mTOR和S6K1的基因表达,但下调了真核细胞翻译启始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1,4EBP1)的基因表达。

此外,Lys还能调节乳腺上皮细胞ATT的表达,ATT可以感知胞内氨基酸水平的变化,介导氨基酸信号传导途径的激活,进一步调控乳蛋白的合成。以BMECs为模型的体外研究发现,1.0 mmol/LL-Lys不仅可提高钠离子(Na+)和氯离子(Cl-)依赖性的中性 B0,+氨基酸转运载体(B0,+amino acid transporter,ATB0,+)的基因和蛋白表达量,还可上调mTOR和信号转导和转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)的磷酸化水平,进而激活mTOR和Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/STAT5信号通路,提高BMECs中β-酪蛋白的合成[17]。

3 BCAAs对BMECs乳蛋白合成的调控

BCAAs包括亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val),占奶牛乳腺总氨基酸供给量的40%左右,其对奶牛乳腺乳蛋白的合成具有重要调节作用[21-22]。Kim等[23]在BMECs中添加0.6 mmol/L Val促进了BMECs中β-酪蛋白的合成。董贤文[24]研究发现,提高MAC-T中Ile的供给量可以促进α-s1酪蛋白的基因表达。作为乳蛋白合成的底物,适量添加BCAAs可以改善细胞环境的营养水平,过量则会造成氨基酸之间的拮抗与不平衡[21]。Qiu等[25]研究发现,当Leu浓度低于0.75 mmol/L时,它能促进细胞增殖、β-酪蛋白和α-酪蛋白的合成,且呈剂量依赖性。当Leu浓度逐渐升高(>0.75 mmol/L)时,Leu对乳蛋白合成的刺激作用逐渐减弱。同时,Ile也有相似的试验结果,王哲[26]研究发现,高浓度(1.0和1.25 mmol/L)的Ile对乳蛋白合成有抑制作用。

除了作为营养物质外,BCAAs可以通过特定的信号通路调节BMECs乳蛋白合成,特别是PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/mTOR信号通路[27-28]。Leu可以独立调节牛乳腺组织 mTOR信号通路和蛋白质合成[29]。Zhao等[30]研究表明,在BMECs中添加1.8 mmol/L Leu通过上调mTOR、4EBP1和S6K1的蛋白表达及磷酸化水平,进而促进了CSN1S1、CSN2和CSN3的基因表达以及酪蛋白合成。Dong等[31]将Val浓度从142 μg/mL增加到156 μg/mL促进了BMECs乳蛋白的合成,这与AKT、S6K1和mTORC1的磷酸化水平提高有关。与此相反,BCAAs缺乏会通过抑制单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 50-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/mTOR信号通路降低BMECs中酪蛋白的转录和翻译[32]。Doelman等[33]研究发现,BCAAs缺乏会促进eIF2Bε和eIF2α的表达从而抑制mTOR的活性,引起奶牛乳腺中酪蛋白合成相关基因mRNA的表达和酪蛋白含量的降低。

4 Arg对BMECs乳蛋白合成的调控

Arg作为一种功能性氨基酸,其不仅是蛋白质合成的前体物质,在动物乳腺中还可以通过Arg代谢途径调控乳蛋白的合成。Arg在乳腺细胞中通过精氨酸-鸟氨酸代谢途径调控细胞增殖、蛋白质周转以及合成[34]。有研究表明,泌乳期荷斯坦奶牛乳蛋白合成的增加可能是因为乳腺组织中精氨酸酶和鸟氨酸脱羧酶活性显著上调以及多胺类物质生成增多引起的[35]。精氨酸-鸟氨酸-多胺是调控酪蛋白合成的关键代谢通路,丁洛阳[36]试验发现, BMECs中精氨酸-鸟氨酸-多胺代谢通路受到抑制后,BMECs的增殖和细胞中酪蛋白合成同时受到显著抑制。

Arg还可以通过提高S6K1和4EBP1等信号分子的磷酸化水平进而激活mTOR信号通路调控奶牛乳蛋白合成。曹越等[37]研究发现,2.80 mmol/L Arg通过上调mTOR 信号通路相关信号分子AKT、mTOR、S6K1和4EBP1的基因表达量进而促进BMECs中CSN1S1和CSN3的mRNA表达以及αs1-酪蛋白蛋白表达。此外,Arg浓度为556 mg/L时可通过激活JAK2/STAT5和mTOR信号通路进而促进CSN1S1、CSN2和CSN3的基因表达和酪蛋白合成[38]。然而,Hu等[39]研究发现,当BMECs中Arg浓度为175 μg/mL时会抑制AMPK/mTOR信号通路进而降低α-酪蛋白的蛋白表达。Arg还能通过调控microRNA (miRNA)的表达进而影响酪蛋白合成,Zhang等[40]通过体外BMECs培养和体内灌注试验得出,Arg可以通过上调miR-743a和miR-712的表达进而促进酪蛋白的合成。

5 EAA平衡模式对BMECs中乳蛋白合成的调控

合成乳蛋白所需的氨基酸大部分来自于血液,但乳腺对氨基酸的摄取率相对较低,只有动脉中氨基酸总量的22%[41]。在生产实践中,为了提高乳蛋白含量通常会在饲粮中添加过量的氨基酸,但这会导致成本增加以及环境污染[42]。

据报道,饲粮中添加适宜比例的Met和Lys可显著提高粗蛋白质利用率和产奶量[43]。Nan等[5]研究发现,Lys∶Met为2.9∶1.0是促进体外培养的BMECs酪蛋白表达的最佳比例。Lys与其他氨基酸的比例也会影响BMECs乳蛋白的合成。Gao等[44]研究发现,当Lys、His、Met和Leu的比例为6∶5∶1∶7时可以显著促进BMECs中酪蛋白的合成。然而,提高Met供给量,使Lys与Met比例不平衡时会抑制BMECs中酪蛋白合成[45]。因此,与增加饲粮中EAA的绝对含量相比,适宜的氨基酸比例是提高乳蛋白含量的更可行方式[46]。

一方面,平衡的EAA模式可以激活mTOR信号通路并提高其下游信号分子的蛋白表达和磷酸化水平促进BMECs中β-酪蛋白合成[44]。Nan等[5]研究表明,Lys和Met处于平衡模式时通过提高mTORC1的mRNA表达、蛋白表达以及磷酸化水平进而促进BMECs中酪蛋白合成。然而,提高Met供给量,使Lys和Met的比例失衡会抑制BMECs中β-酪蛋白合成,mTORC1和AMPK的蛋白表达和磷酸化水平也相应降低[39,45]。同时,EAA还会通过GCN2信号通路调控乳蛋白合成。Edick等[47]研究发现,在Arg、Leu和Lys缺乏的EAA失衡培养基中GCN2被激活,进而引起eIF2α的磷酸化,磷酸化的eIF2α会抑制mRNA的翻译,最终导致BMECs中乳蛋白的合成量显著降低。

另一方面,平衡的EAA模式还可通过增加乳腺对氨基酸的摄取和ATT的表达来提高乳蛋白产量[48-49]。Dong等[45]研究发现,EAA比例失衡时会降低乳腺对EAA的摄取,下调编码SNAT2的基因溶质载体家族38成员2(SLC38A2)的表达进而抑制BMECs中β-酪蛋白合成。进一步研究发现,当Lys和Met比例平衡时,提高苏氨酸(Thr)、Ile、Val、和 Leu的浓度会提高编码4F2hc的基因溶质载体家族3成员2(SLC3A2)的表达进而促进BMECs中β-酪蛋白和αs1-酪蛋白合成[31]。

6 小 结

BMECs是乳腺合成乳蛋白的基本功能单位,乳蛋白的合成是一个复杂的代谢过程。EAA作为重要的乳成分前体物,其不仅是乳蛋白合成的重要底物,还可以作为信号分子调控乳蛋白合成。目前,在EAA调控BMECs内乳蛋白合成方面的研究已取得一些进展,我们已知EAA一方面可以作为底物影响乳蛋白合成,另一方面还能作为细胞信号物质通过影响细胞增殖、mTORC1、GCN2相关信号通路、ATT表达以及miRNA表达来调控BMECs中乳蛋白合成。然而,由于多种EAA之间存在协同或拮抗作用,对于EAA调控BMECs内乳蛋白合成的复杂机制我们还知之甚少,仍需要结合现代生物分子学技术,依靠代谢组学、转录组学或蛋白质组学等技术手段从吸收代谢、基因网络构建和功能蛋白活性等层面进行深入研究。随着对氨基酸调控BMECs乳蛋白合成调控机制的深入了解,将有助于奶牛氨基酸精准营养的实施,为进一步优化泌乳奶牛饲粮氨基酸供给模式及降低生产成本提供理论依据。