SCF/c-Kit 信号通路通过抑制肥大细胞增殖调控影响病理性瘢痕形成的研究

吴海燕，王永军，段志娟，王娟，罗宏

（郴州市第一人民医院，湖南 郴州 423000）

病理性瘢痕即疙瘩瘢痕和增生性瘢痕，由于皮肤创伤过度愈合，是一种以成纤维细胞过度增生、细胞外基质长期异常积累为特征的临床和病理实体[1]，因其临床侵袭性、引起挛缩和病理上出现透明胶原/真皮结节而臭名昭著[2]。一直以来，大部分研究都关注在成纤维细胞在创面愈合过程中的增殖对病理性瘢痕形成的影响[3]。迄今为止，有效和具体的治疗方法很少，即使是手术切除也被高复发率所阻碍。有临床数据发现，肥大细胞数量在病理性瘢痕组织中增加，但其对病理性瘢痕形成的作用仍不清楚且研究颇少[4]。因此，深入研究病理性瘢痕形成的过程，有助于阐明病理性瘢痕的发病机制。

酪氨酸激酶受体c-Kit 及其唯一已知的配体干细胞因子（Stem cell factor，SCF）是促进细胞生长、存活、分化、迁移和分泌等基本细胞功能的重要关键因子[5]。尤其在胚胎发育过程中，SCF/c-Kit 轴介导了造血、中枢神经系统、肠道黑色素生成的重要信号[6]。激活的SCF/c-Kit 通路也经常出现在肿瘤和癌前病变中，识别出c-Kit 是原癌基因[7-8]。临床研究发现，c-Kit 阳性肥大细胞在人瘢痕组织中显著增多，人皮肤瘢痕组织中肥大细胞糜蛋白酶、胰酶和c-Kit 表达也显著改变[9]。此外，还有报道SCF/c-Kit 参与了肥大细胞增生的炎性过程[10]。而病理性瘢痕组织肥大细胞数目比正常皮肤增多[4]。这些数据提示SCF/c-Kit 信号通路可能参与了病理性瘢痕的形成。

本研究旨在阐明SCF/c-Kit 信号通路与病理性瘢痕之间的作用关系以及可能的调节途径，进一步为阐明病理性瘢痕的发病机制提供了实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本 所有临床样本均来自我院，病理性瘢痕标本（主要来自烧伤、创伤、外科手术患者）35 例，正常皮肤标本（主要来整形外科手术切除的健康人皮肤）30 例。获取标本后立即冷冻。所有涉及人体皮肤标本均已获得患者本人书面知情同意进行，所有研究均获得本医院伦理委员会的批准与监督。

1.1.2 动物 选取30 只4～6 周龄巴比赛（BALB/c）裸鼠，体质量15～22 g，小鼠被置于特定的无病原体环境中饲养，自由饮食和饮水。

1.1.3 试剂 甲苯胺蓝染色试剂盒购于北京Solarbio 公司；人的SCF ELISA 试剂盒购自美国R&D 公司；磷酸酶抑制剂购自美国Sigma-Aldrich 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自美国Millipore 公司；抗体SCF、c-Kit、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）购自美国Invitrogen 公司；辣根过氧化物酶（HRP）鼠抗购自美国Abcam 公司；si-NC 和si-SCF 质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司（上海生工）构建；水合氯醛购自宝鸡市国康生物科技有限公司；胶原纤维（V.G）染色剂购自上海美轩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甲苯胺蓝染色 称取甲苯胺蓝0.5 g，定容至100 mL 蒸馏水中配制成甲苯胺蓝染色液。将收集的临床标本和裸鼠瘢痕组织进行石蜡组织切片（4 μm），脱蜡至水，用甲苯胺蓝染色液染色10 min，蒸馏水洗2 次。冰醋酸分化液浸润30 s 左右，至颗粒清晰为止（显微镜控制）；再用蒸馏水洗2 次，无水乙醇快速脱水，滤纸吸干，最后用二甲苯透明和中性树胶封片。

1.2.2 酶联免疫吸附测定（ELISA） 收集病理性瘢痕患者和健康者的血清，使用ELISA 试剂盒检测SCF 的浓度，所有步骤严格按照ELISA 试剂盒说明书进行。所有的检测均做3 个复孔，最后取平均值。

1.2.3 蛋白质印记法（Western blotting） 将收集的标本用含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液和磷酸酶抑制剂进行裂解提取蛋白。使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）进行电泳，并将蛋白转移到PVDF 膜。用含5%BSA 的Tris 盐酸缓冲液封闭1 h 后，用anti-SCF、anti-c-Kit 抗体在4 ℃孵育过夜。然后，膜与相应的氧化物酶（HRP）共轭二抗室温孵育1 h。用anti-GAPDH 抗体作为内参。采用增强型化学发光（ECL）检测蛋白，使用Image J 软件分析蛋白强度。

1.2.4 质粒的构建 使用小干扰核糖核酸（siRNA）沉默SCF。设计SCF 上下游引物，正向序列为：si-SCF：UGAAGAGGAUAAUGAGAUA；si-NC：UAGCGACUA ACAUCAA。在国家生物技术信息中心（NCBI）上进行核对，然后送至公司进行合成测序，再按照si-RNA的构建方法进行质粒重构[11]，即可得到si-NC 和si-SCF 质粒。

1.2.5 瘢痕裸鼠模型的建立[12]及分组 取瘢痕患者的瘢痕组织，切成0.8 cm×0.8 cm×0.5 cm 的组织块备用。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在裸鼠背部切开1 cm×2 cm 的切口，将瘢痕组织块移植到裸鼠皮下，进行常规缝合包扎。16 d 后随机将造模成功的裸鼠随机分为模型+si-NC 组和模型+si-SCF 组，每组10 只，分别于裸鼠瘢痕内注射si-NC、si-SCF 质粒和脂质体混合液0.25 mL[每个EP 管内含质粒30 g、脂质体75 μL 及磷酸盐缓冲液（PBS）共0.25 mL]，另设对照组，只在裸鼠背部切开等体积切口，注射等体积PBS 再进行常规缝合。7 d 后将各组裸鼠断颈处死进行瘢痕组织检测。

1.2.6 瘢痕体积大小测量 分别于注射质粒前后用游标卡尺测量各组裸鼠瘢痕体积，记录瘢痕的长、宽、高。再根据公式计算瘢痕体积，瘢痕体积（mm3）=长×宽×高。

1.2.7 裸鼠标本的收集 在测量完各组裸鼠的瘢痕体积后立即取各组裸鼠的瘢痕标本，一部分标本浸泡在4%的甲醛中并进行石蜡切片（厚5 μm），待后续各组切片染色使用，一部分标本放置在无菌的EP 管中，保存在-80 ℃待做Western blotting。

1.2.8 瘢痕组织Ⅰ型胶原含量检测 用V.G 染色检测各组裸鼠瘢痕组织Ⅰ型胶原含量。将组织石蜡切片先常规脱蜡至水，蒸馏水清洗。切片上滴染V.G液，蒸馏水洗2 次。无水乙醇脱水，二甲苯透明和中性树胶封片，在光学显微镜下观察。

1.3 统计学分析 采用GraphPad 7 软件进行数据分析，至少取3 次独立实验结果，2 组间统计学差异分析采用双尾无配对或配对T-test。相关分析采用Pearson 相关检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理性瘢痕患者肥大细胞增多 笔者通过甲苯胺蓝染色对临床病理性瘢痕患者的皮肤瘢痕组织进行肥大细胞的检测，结果显示与健康者皮肤组织相比，病理性瘢痕患者的瘢痕组织出现大量肥大细胞浸润，见图1。

图1 患者瘢痕组织的肥大细胞数量（甲苯胺蓝染色×400，黑色箭头指向肥大细胞）

2.2 病理性瘢痕患者瘢痕组织中SCF/c-Kit 高表达 ELISA 结果显示，相比于健康者，病理性瘢痕患者血清中SCF 含量异常升高（P<0.001），见图2A。Western blotting 结果显示，相比于健康者皮肤组织，病理性瘢痕患者瘢痕组织中SCF/c-Kit 表达显著上调（P<0.001），见图2B、C。因此，SCF/c-Kit 在病理性瘢痕患者瘢痕组织中高表达。

图2 SCF/c-kit 在瘢痕患者血清和瘢痕组织中的表达

2.3 沉默SCF 对病理性瘢痕裸鼠模型瘢痕组织中c-Kit 的影响 笔者建立了病理性瘢痕裸鼠模型，移植人瘢痕组织块后小鼠体内基本无免疫排斥，见图3A。同时构建了si-SCF 质粒注射入模型裸鼠的瘢痕内。将动物分为对照组、模型组、模型+si-NC 组和模型+si-SCF 组。Western blotting 结果显示，相对于对照组，模型组裸鼠瘢痕组织内SCF/c-Kit 蛋白表达显著升高；相对于模型组，模型+si-NC 组SCF/c-Kit 蛋白表达差异无统计学意义，说明注射si-NC质粒对裸鼠SCF/c-Kit 蛋白表达无影响；而相对于模型+si-NC 组，模型+si-SCF 组显著降低了裸鼠瘢痕组织内SCF/c-Kit 蛋白表达，说明si-SCF 质粒构建成功，同时也降低了c-Kit 蛋白表达（P<0.05），见图3B、C。因此，SCF/c-Kit 蛋白表达在病理性瘢痕裸鼠模型中高表达，与临床数据一致；当在模型裸鼠的瘢痕组织中沉默SCF 时，c-Kit 蛋白表达被显著下调。

图3 各组裸鼠模型瘢痕组织中SCF/c-Kit 的蛋白表达

2.4 沉默SCF 对病理性瘢痕裸鼠瘢痕体积的影响 模型裸鼠注射PBS 或si-NC、si-SCF 质粒前后瘢痕体积大小检测，相对于模型组，模型+si-NC 组注射前后裸鼠的瘢痕体积无明显变化；而相对于模型+si-NC 组，模型+si-SCF 组注射后裸鼠的瘢痕体积显著减小（P<0.05）。因此，沉默SCF 抑制了病理性瘢痕裸鼠模型瘢痕体积的增大，见表1。

表1 模型裸鼠瘢痕体积大小 （mm3，±s）

表1 模型裸鼠瘢痕体积大小 （mm3，±s）

注：注射后相对于模型组+si-NC 组，*P<0.05。

组别模型组模型+si-NC 组模型+si-SCF 组n 10 10 10注射前 注射后256.77±26.01 252.23±30.12 253.61±29.23 255.12±27.34 254.65±24.78 167.98±22.05*

2.5 SCF 对病理性瘢痕裸鼠瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量的影响 各组裸鼠瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量通过V.G 染色进行检测，Ⅰ型胶原（红色）主要分布在真皮的细胞间质。相比于对照组，模型组裸鼠瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量增多；相对于模型组，模型+si-NC 组裸鼠瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量无变化；而相对于模型+si-NC 组，模型+si-SCF 组裸鼠瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量显著降低。因此，沉默SCF 抑制了病理性瘢痕裸鼠模型瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量的增多，见图4。

图4 各组裸鼠瘢痕组织的Ⅰ型胶原含量（V.G 染色×200）

2.6 SCF 对病理性瘢痕裸鼠肥大细胞的影响 各组裸鼠瘢痕组织中肥大细胞数目的变化通过甲苯胺蓝染色进行评估。相比于对照组，模型组裸鼠瘢痕组织中肥大细胞数目增多；相对于模型组，模型+si-NC 组裸鼠瘢痕组织中肥大细胞数目无变化；而相对于模型+si-NC 组，模型+si-SCF 组裸鼠瘢痕组织中肥大细胞数目减少得多（P<0.001），见图5。因此，沉默SCF 抑制了病理性瘢痕裸鼠模型瘢痕组织中肥大细胞的增多。

图5 各组裸鼠瘢痕组织的肥大细胞（甲苯胺蓝染色×400）

3 讨论

病理性瘢痕通常被认为是长时间的、异常的伤口愈合的结果，表现为成纤维细胞异常增殖参与和分泌大量的细胞外基质[3]。病理性瘢痕可分为疙瘩瘢痕和增生性瘢痕，是由皮肤损伤和刺激引起的，包括创伤、虫咬、烧伤、外科手术、接种疫苗、皮肤穿孔、痤疮、毛囊炎、水痘和带状疱疹感染[13]。疙瘩瘢痕典型的病理特征是存在增厚和透明的“瘢痕”胶原[14]，增生性瘢痕的典型特征是过度纤维化而产生胶原紊乱[15]。由于疙瘩瘢痕和增生性瘢痕的临床和病理表现重叠，且没有合适的动物模型，其病因尚不清楚。一旦疤痕组织成熟，周围组织就不可能再生出正常的真皮组织。因此，了解病理性瘢痕形成的基本机制，将有助于临床和组织病理学对这些重要病变的分类和治疗。

SCF 是酪氨酸激酶Ⅲ家族的一员，由c-Kit 基因编码，SCF 可以与c-Kit 受体结合严格调控几个复杂的生物程序，包括造血、肥大细胞发育、皮肤色素沉着和配子生成[16]。肥大细胞是重要的免疫细胞，分布在全身的各个部分，包括皮肤。研究表明，在创面愈合过程中，肥大细胞能够促进急性炎性反应、刺激创面上皮化与血管再生直至贯穿整个瘢痕形成过程中[17]。所以肥大细胞的异常与增生性瘢痕的形成有密切联系。SCF 最初被认为是肥大细胞的生长因子，SCF/c-Kit 信号通路可能是影响肥大细胞数量、表型和功能的最重要因素之一，可以通过调控肥大细胞和黑色素细胞增殖来改善乳腺癌和肝炎等疾病[18-19]。SCF/c-Kit 信号通路还对细胞的迁移、增殖和分化至关重要[5]。最新研究发现，SCF 和c-Kit在疙瘩瘢痕组织中表达上调，同时在瘢痕样成纤维细胞和瘢痕样角质形成细胞中表达也上调，SCF/c-Kit 信号通路还通过调控成纤维细胞和角质形成细胞增殖来治疗疙瘩瘢痕的形成和创面愈合[20]。但未有报道说明肥大细胞中的SCF/c-Kit 信号通路对病理性瘢痕的影响。因此，笔者探究了SCF/c-Kit 信号通路通过调控肥大细胞增殖来改善病理性瘢痕的机制。笔者的研究结果表明，病理性瘢痕患者的瘢痕组织中存在大量肥大细胞，SCF 作为肥大细胞的生长因子，被发现在病理性瘢痕患者的血清中高表达，同时SCF/c-Kit 的蛋白表达在患者瘢痕组织中也高表达。为了进一步探究其中的分子机制，笔者建立了病理性瘢痕裸鼠模型，注射si-NC 和si-SCF质粒至瘢痕组织，Western blotting 结果显示模型组上调了SCF/c-Kit 的蛋白表达，而沉默SCF 下调其受体c-Kit 表达；游标卡尺测量瘢痕体积发现，模型组裸鼠的瘢痕体积大，而沉默SCF 可以抑制病理性瘢痕裸鼠瘢痕体积的增大；V.G 染色发现，模型组裸鼠瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量显著增多，而沉默SCF抑制了Ⅰ型胶原含量的增多；甲苯胺蓝染色发现，模型组裸鼠瘢痕组织中肥大细胞大量累积，与临床患者体内一致，当沉默SCF 后肥大细胞的数目显著降低。以上数据说明SCF/c-Kit 信号通路对病理性瘢痕组织中瘢痕体积、Ⅰ型胶原含量和肥大细胞数目有调控性。

综上所述，笔者的研究揭示SCF 和c-Kit 蛋白表达在病理性瘢痕患者的血清和瘢痕组织中高表达，且肥大细胞异常增殖；通过沉默SCF 可以下调c-Kit 表达，抑制病理性瘢痕体积的增大和瘢痕组织中Ⅰ型胶原含量的增多，并且抑制了肥大细胞的增殖。本研究为病理性瘢痕的形成和发病机制提供了一个新的视角。