高锰酸钾脱色法在恶性黑色素瘤HE 染色和免疫组化染色中的应用

刘鑫鹏，顾安康，李鹏，贾文娟，王紫阳，张理涛

（天津市中医药研究院附属医院，天津 300120）

恶性黑色素瘤（Malignant melanoma，MM）是一种有免疫原性的由黑色素细胞转化而来的恶性肿瘤，其发生发展受到多种因素影响。MM 在皮肤癌症中所占比例虽然不足5%，但是在皮肤肿瘤相关死亡病例中所占比例高达80%[1]。在病理科的日常工作中，MM 由于黑色素颗粒的存在，致使HE 染色和免疫组化标记时，正常的组织细胞结构和形态被遮盖，同时由于黑色素颗粒在切片中显示为浅黄色至棕黑色，与免疫组化DAB 显色剂显色后颜色相近，若不进行脱色素处理，容易对切片的判读产生影响，因此在染色前进行脱色素处理是一个必要的措施。本文探讨不同浓度高锰酸钾脱色法在染色中的应用价值，以筛选更适合的脱色素浓度。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2004—2013 年期间天津市肿瘤医院病理科8 例明确诊断为MM 患者的皮肤组织标本。所有组织均经过10%中性甲醛固定并包埋成蜡块，每个蜡块连续切片10 张捞至黏附载玻片，厚度为4 μm，70 ℃烤箱1.5 h 备用。

1.2 主要试剂 0.10%、0.25%及0.50%高锰酸钾溶液（将0.2 g、0.5 g 及1.0 g 高锰酸钾粉末分别溶于200 mL 蒸馏水中配制成，天津市化学试剂一厂），2%草酸水溶液（将4 g 草酸粉末溶于200 mL 蒸馏水中配制成，天津市化学试剂一厂），磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2～7.4，北京中杉金桥生物技术有限公司），苏木素[福晨（天津）化学试剂有限公司]，伊红（天津市光复精细化工研究所），EDTA修复液（pH8.0，北京中杉金桥生物技术有限公司），S-100 一抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），通用型酶标二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），DAB 显色液（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 脱色素方法 切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗，入PBS 平衡5 min×2 后取出分为3 组。①分别浸入0.10%、0.25%、0.50%高锰酸钾溶液中，10 min后取出2%草酸漂白30 s 并观察，3 组切片色素依然存在，但残留色素随着高锰酸钾溶液浓度的增加而减少。②将所有切片再分别浸入高锰酸钾溶液中10 min 后2%草酸漂白30 s 并观察，发现0.25%和0.50%浓度组色素完全消失，而0.10%浓度组中的色素除组织本身色素较少的完全消失外，色素仍有部分残留，见图1。③取出所有切片，流水冲洗1 min至蒸馏水，入PBS 平衡5 min×2，后续分别行HE 染色和免疫组化染色。

图1 色素多与色素少标本切片经不同浓度高锰酸钾溶液脱色20 min 后对照

1.3.2 HE 染色 所有蜡块各4 张切片常规脱蜡至水，①选取其中一张切片，不行脱色素处理，直接常规HE 染色；②选取另外3 张切片，分别以不同浓度高锰酸钾溶液进行脱色素处理，后续同常规HE 染色步骤。

1.3.3 免疫组化染色 为进一步探讨脱色素处理在免疫组化方面的应用价值，将切片常规脱蜡至水，①选取其中一张切片，不行脱色素处理，直接常规免疫组化染色，以做对照；②选取另外3 张切片，先进行抗原修复，再分别以不同浓度高锰酸钾溶液进行脱色素处理，后续同常规免疫组化染色步骤。

2 结果

2.1 HE 染色结果 对未进行脱色素处理的切片行常规HE 染色，镜下显示有大量棕黑色色素沉积，见图2。经不同浓度脱色素处理的切片亦行HE 染色，镜下显示0.25%和0.50%浓度组黑色素均消失，0.10%浓度组还有残留部分黑色素颗粒。但0.50%浓度组在染色的过程中，切片或发生组织周边卷曲翘起或发生严重脱片，致使无法对切片进行准确判读。0.25%浓度组染色后切片的组织结构清晰完整、无脱片或卷曲现象出现，视野干净无黑色素颗粒，见图3。

图2 未脱色素切片（HE 染色×100）

图3 脱色素后切片（HE 染色×100）

2.2 免疫组化染色结果 免疫组化染色结果与常规HE 染色结果有相似性。观察未进行脱色素处理的免疫组化切片，发现有棕黄色或棕黑色色素颗粒沉积，见图4，对正确判读结果有一定的影响。而经过脱色素处理的切片中：①0.50%浓度组在进行免疫组化的过程中即出现严重脱片或卷曲现象，甚至部分组织无法后续操作，无法进行判读；②0.25%组几乎未出现脱片现象，组织结构清晰完整，阳性定位基本准确，脱色效果尚可，见图5、表1；③0.10%浓度组因色素较多组织中残留部分黑色素颗粒，可能会影响结果的判读，从而造成假阳性。

表1 不同浓度高锰酸钾溶液脱色素结果对比

图4 未脱色素切片（S-100 染色×40）

图5 脱色素后切片（S-100 染色×40）

3 讨论

黑色素颗粒存在于MM 中，颜色可由浅黄色至棕黑色，且不易去除，对其常规处理HE 染色或者免疫组化染色后，依然存在于组织中，会对病理诊断产生影响。黑色素有强还原性，可以与强氧化剂高锰酸钾反应，达到脱色的目的[2]。较好的脱色素法应兼具脱色后保持组织本身完整的组织细胞形态、脱色素完全、不影响抗原抗体的结合。截止目前，既往报道的脱色素方法很多，诸如：高锰酸钾脱色法[3-4]、酸化高锰酸钾法[5]、过氧化氢法[6-7]、双重氧化法[8]等，但是在病理科的平时工作中，较为常用的方法依然是高锰酸钾脱色法，此法优点在于相对于过氧化氢法较快速，相对于酸化高锰酸钾法更温和。

从本实验来看，0.25%高锰酸钾溶液脱色素总体效果优于0.10%浓度组和0.50%浓度组，相对0.50%浓度组更加温和，不易出现脱片，能获得结构完整无色素颗粒的切片。但是，与既往报道相比，本研究还发现0.10%浓度组在脱色素的过程中，如果组织标本本身含有的色素较少，此浓度在20 min 终止脱色时，也可以达到使色素完全脱去的目的，同时因为所用浓度降低，也可能会减少强氧化剂对抗原的影响[3-4]。

S-100 在正常的黑色素细胞、神经鞘细胞、肌上皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、朗格汉斯细胞，以及这些细胞来源的肿瘤均可阳性表达，同时也是MM十分敏感的标志物，阳性率可达95%以上，在病理诊断中为经常使用的抗体之一[9]。本研究利用不同浓度对切片脱色素并行S-100 免疫组化染色，0.25%浓度组可以获得组织完整结构清晰的切片，并且免疫组化定位基本准确，对抗原几乎无影响。而0.50%浓度组会出现卷曲或严重脱片现象，0.10%浓度组可能会含有未脱净的黑色素颗粒，从而影响判读。

综上所述，0.25%高锰酸钾脱色法适用于大部分含有黑色素的组织切片，若组织标本本身含有的色素较少且颜色较浅，也可选用0.10%高锰酸钾溶液进行氧化处理。