二代测序技术在原发灶不明肿瘤诊疗中的研究进展*

陈美丽 钱汉清 张全安 杨艳 马亚军

原发灶不明肿瘤（cancer of unknown primary，CUP）是一类相对罕见的肿瘤，即在体内发现了恶性肿瘤细胞，但无法通过临床、影像、病理及实验室指标等全面检查从解剖学上确定原发灶部位的转移性肿瘤。大多数CUP 患者由于原发灶不明确，通常只能接受含铂/紫杉类的经验性化疗，预后较差，生存期较短，中位总生存期＜1 年[1-3]，所以积极寻找原发部位、研究组织类型或分子免疫特征对改善患者的预后具有重要意义。第二代测序（next-generation sequencing，NGS）也称高通量测序，是目前最常用的基因检测手段之一，可以在较短时间内检测出肿瘤患者的基因变异情况，辅助指导临床诊疗。欧洲肿瘤内科学会（ESMO）、国家综合癌症网络（NCCN）及中国抗癌协会都发布了关于在CUP 患者中使用NGS 的建议，NGS 可以帮助50.9%的CUP 患者找到原发灶[4]，并可检测出具有临床指导意义的基因改变[5]，包括靶向治疗靶点和免疫治疗生物标记物。本文针对NGS 样本的选择、NGS 指导下的CUP 患者的组织溯源、分子特征、指导治疗等方面进行综述。

1 NGS 样本的选择

对于适合NGS 检测分析样本的选择，临床中首选新鲜肿瘤组织标本，也可选择福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织、肿瘤细胞学样本及血浆等。未接受过靶向/免疫药物治疗的患者，NGS 检测应首选经病理评估的组织样本，优先使用手术切除样本，也可选择活检样本，再次检测可选择液体活检样本进行动态监测；接受过靶向/免疫药物治疗的患者，应尽可能使用治疗后的样本，进而寻找治疗后新出现的耐药突变。基于手术切除或穿刺活检的肿瘤组织是CUP 分子检测的主要样本，当转移性肿瘤组织样本难以获取或组织样本质控不合格时，体液样本，尤其是外周血循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）则是研究CUP起源和分子特征的一种可行方法。与组织学检测相比，外周血ctDNA 检测具有无创或微创、可反复取材等优势[6]，但受正常细胞胚系变异或克隆性造血细胞体系突变干扰，也会导致假阳性结果[7-8]，假阳性率＜1%[9]。

2 NGS 在CUP 诊疗中的意义

2.1 组织溯源，明确诊断

基因表达谱可在分子水平揭示肿瘤的组织起源，通过对比分析待测肿瘤组织样本与已知来源肿瘤分子层面的相似性，可以鉴别其肿瘤类型，寻找原发灶。日本研究团队的一项前瞻性、多中心、非随机的临床Ⅱ期 研 究[10]招募了111 例CUP 患者，基 于NGS 的RNA 和DNA 图谱分析预测出15 个肿瘤原发部位，其中最常见的是肺癌（21.6%）、肝癌（15.5%）、肾癌（15.5%）、结直肠癌（12.4%），这与既往尸检分析的结果类似[11]。Schipper 等[12]基于全基因组测序设计了一种预测算法，在CUP 队列中，最常见的原发肿瘤略有不同，分别为非小细胞肺癌、胃食管癌、胰腺癌和结直肠癌。

Mo 等[13]报道了1 例原发灶不明同时伴乳腺、肺、胃和卵巢多发性肿瘤的患者，在乳腺和肺肿瘤组织中使用NGS 检测到伴有棘皮动物微管结合蛋白样与间变性淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）重排，该基因改变在非小细胞肺癌中较常见，综合免疫组织化学及NGS 结果考虑原发灶为肺。Yu 等[14]报道了1 例胸骨后恶性占位性病变的患者，影像学均无法确定原发部位，通过NGS 检测到人表皮生长因子受体2（receptor tyrosine-protein kinase 2，ERBB2）扩增，协助临床找到原发灶为乳腺。本中心也报道了1 例影像学和常规组织病理学无法确诊，经NGS 测序明确诊断的罕见胰腺癌结肠转移的案例[15]。综上所述，NGS 的组织溯源作用主要表现在以下几个方面：1）当影像及组织病理学同时发现多处肿瘤病灶，无法明确原发病灶时；2）当影像及组织病理学只发现一处病灶，无法明确原发病灶时；3）当患者在肿瘤病史（包括单原发或多原发）基础上出现新的病灶，无法明确为转移还是继发时。

2.2 揭示分子特征，指导个体化治疗

2.2.1 基于基因变异的靶向治疗 NGS 技术对一定数量的癌症相关基因编码区进行大规模基因组测序来分析存在的基因组改变以指导临床治疗，这些基因组改变包括突变、基因重组、DNA 插入/缺失、拷贝数变化等。Ross 等[16]对200 例CUP 组织标本进行NGS检测，发现169 例（85%）检测到一个或多个潜在可靶向治疗的基因变异，在原发灶不明的腺癌中有72%的CUP 患者存在临床上常见的酪氨酸激酶信号通路上的基因变异，其中最常见的基因变异为肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、Kirsten 大鼠肉瘤病毒基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、细胞周期依赖性激酶抑制因子2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、髓细胞组织增生原癌基因（myelocytomatosis oncogene，MYC）、富含AT 的相互作用域1A 基因（AT-rich interaction domain 1A，ARID1A）、髓样细胞白血病蛋白1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、ERBB2、上皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）等，这与以往报道的CUP 队列相似[10,17]。Varghese 等[18]对150 例CUP 患者进行NGS 检测，结果显示137 例（91%）至少检测到一种基因改变，45 例（30%）具有靶向治疗的基因改变，接受靶向治疗的患者治疗失败时间1～14个月不等。Jia 等[19]对1 例CUP 患者的外周血进行NGS 检测，检出乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）R71K突变，接受奥拉帕利治疗后无进展生存期超过15 个月。1 例原发灶不明的转移性腺癌患者组织经NGS 检测发现间质表皮转因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）扩增，服用克唑替尼1 个月后获得完全缓解，肿瘤标志物恢复正常水平[20]。大多数CUP 患者可通过NGS检测出至少一个基因改变，是靶向治疗潜在的优势群体。

随着泛瘤种的靶向药物逐渐获批上市，治疗不再局限于单一瘤种，这为CUP 带来了福音。目前泛癌种靶向基因主要包括神经营养因子受体酪氨酸激酶(neurotrophin receptor tyrosine kinase,NTRK) 融合、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）V600E 突变和转染重排原癌基因（rearranged during transfection proto-oncogene，RET）融合。NTRK抑制剂拉罗替尼是全球首个泛瘤种的靶向药物，NTRK基因改变在CUP 中的发生率为12%，二线接受NTRK抑制剂无进展生存期可达9 个月[21]。Ricco 等[22]报道了1 例原发灶不明的大细胞神经内分泌癌的患者，NGS 检测出BRAF V600E突变，化疗进展后使用达拉非尼联合曲美替尼治疗达到部分缓解，并通过检测cfDNA 中BRAF V600E的表达情况对疾病的反应进行动态监测。RET融合常见于分化良好的甲状腺癌和非小细胞肺癌，在CUP 中的发生率为0.7%[23-24]。LIBRETTO-001 研究纳入41 例RET融合阳性CUP 患者进行疗效分析发现，总体客观缓解率为 44%，缓解持续时间为 24.5 个月，其中CUP 患者对塞普替尼的治疗也有客观反应[25-26]。

综上所述，NGS 检测可以帮助CUP 患者找到可指导靶向治疗的基因变异，筛选CUP 靶向治疗的获益人群，临床疗效的评估仍需大样本的临床研究进一步探索。

2.2.2 基于肿瘤突变负荷、程序性细胞死亡-配体1、微卫星不稳定状态的免疫治疗 肿瘤突变负荷高（tumor mutation burden high，TMB-H）、微卫星高度不稳定（microsatellite instability high，MSI-H）及程序性细胞死亡-配体1（programmed cell death-ligand 1，PDL1）高表达已经被批准作为评估免疫检查点抑制剂治疗效果的泛癌种生物标志物，不再考虑肿瘤的组织来源。2017 年美国临床肿瘤学会（ASCO）会议上报道了一项研究，对6 116 例CUP 标本进行测序，其中10.1%的CUP 存在TMB-H（≥20 mut/Mb），1.6%的CUP 存在MSI-H。Gatalica 等[27]报道了相似的比例。Haratani 等[28]通过免疫组化和免疫相关基因表达谱检测确定92 例CUP 患者肿瘤组织中PD-L1 的表达和肿瘤浸润淋巴细胞的密度，结果发现CUP 患者的免疫特征与免疫检查点抑制剂反应性实体瘤相似，表明CUP 患者能从免疫治疗中获益。基于此研究，纳武利尤单抗治疗CUP 疗效的开放标签Ⅱ期研究结果显示[29]，既往接受过化疗的CUP 患者的中位总生存时间为15.9 个月，且在PD-L1 高表达、TMB-H 及MSI-H 的亚组中疗效更好，表明纳武利尤单抗是CUP 的潜在额外治疗选择。纳武利尤单抗也因此于2021 年底在日本获批用于治疗CUP。NCCN 指南推荐对于基因检测结果为错配修复缺陷(dMMR）/MSI-H 或TMBH（≥10 mut/Mb）的 CUP 患者，可以选择帕博利珠单抗治疗。在 Mei 等[30]报道的CUP 患者中，NGS 未检测出特殊靶点，但PD-L1 肿瘤比例评分为80%，TMB 16.7 mut/Mb，在以免疫治疗为主的综合治疗后获得了40 个月以上的生存期，CUP 患者在NGS 指导下的免疫治疗中显著受益。

2.2.3 耐药机制分析与动态检测疗效 由于肿瘤存在异质性，空间异质性会导致局部的组织活检难以准确反映肿瘤的全貌，时间异质性会导致一次检测无法实时监测治疗过程中肿瘤演变以及耐药。外周血NGS 检测既能克服肿瘤空间异质性，可相对全面地反映患者的肿瘤分子特征[31]，也可在治疗不同阶段多次送检，克服肿瘤时间异质性。Zhao 等[32]报道了1 例对化疗不耐受的CUP 病例，胸壁、肝脏、纵隔淋巴结病灶中用NGS 均检测到EML4-ALK融合，经ALK抑制剂克唑替尼治疗有效，耐药后ctDNA 检测显示出ALK L1196M和G1269A耐药突变，更换布加替尼疗效显著。提示ctNDA 在肿瘤获得性耐药机制分析方面发挥着重要作用。同时ctDNA 在CUP 患者的疗效动态评估方面也扮演着重要角色。Jia 等[19]报道了1 例使用奥拉帕利治疗BRCA1突变的CUP 患者，动态监测了ctDNA 中的肿瘤特有突变TP53 S241C持续减少，提示治疗有效。在胃肠胰起源或原发灶不明的神经内分泌癌中NGS 检测也可以用于预测化疗反应[33]。

3 结语与展望

NGS 检测具有所需DNA 样本量较高、操作流程复杂、检测周期长（3～10 d 出报告）、费用相对较高等缺点，但与免疫组织化学、聚合酶链式反应、荧光原位杂交检测等其他传统检测方法相比具有显著的技术优势，它可以同时涵盖数十至数百个基因，检测所有位点突变、未知伴侣的融合基因、拷贝数变异等多种变异类型。同时可评估TMB、MSI 等免疫治疗相关分子标志物，提供全面的基因变异数据，帮助CUP 患者明确诊断，找到原发灶，常见的原发灶包括肺、肝、肾、结直肠、胃、食管等，可以针对原发肿瘤制定相对应的治疗方案及选用适应证范围内的药物。大多数CUP患者都拥有至少1 个临床有意义的基因变异，最常见的基因变异为TP53、KRAS、CDKN2A、MYC、ERBB2等。NGS 为CUP 患者提供精准个体化用药指导，包括选择合适的靶向治疗方案、协助判断是否可使用免疫治疗。泛瘤种靶向药物在CUP 患者中也显示出一定的疗效，但仍需要大样本的研究进一步验证。同时，获得性耐药是影响精准治疗疗效的重要因素，NGS 检测可以用于获得性耐药分子机制分析及后续的用药指导，但目前尚缺乏大样本的临床数据支撑其在临床工作中的常规应用，未来还需开展更多的前瞻性临床研究。

本文无影响其科学性与可信度的经济利益冲突。