铁死亡基因风险评分和PET 代谢参数对晚期非小细胞肺癌预后的影响*

陈婧姼 杨俊泉 高伊函

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的恶性肿瘤之一，5 年生存率不到10%[1]。由于肿瘤样本不足、患者的固有临床风险以及侵入性活检的限制，NSCLC 患者血液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）越来越受到关注[2]。CTCs 是肿瘤细胞的一个子类，能够从原发部位迁移到附近的血管和（或）淋巴管，并在血流微环境中存活[2]。有研究发现，CTCs 水平可以反映肿瘤负荷和生物侵袭性[3]。因此，从患者的外周血中分离CTCs可用于恶性肿瘤的诊断和预后研究。铁死亡被描述为一种非凋亡调节的细胞死亡，其特征是过量活性氧产生和脂质过氧化[4]。近年来发现肺癌中有铁死亡发生，胞质P53RRA-Ras GTP 酶激活蛋白结合蛋白1 相互作用诱导P53 在细胞核中滞留增加，从而触发细胞周期停滞、凋亡和铁死亡[5]。因此，抑制铁死亡可以抑制肺癌细胞的生长和迁移。近期，有学者根据肺癌组织中铁死亡相关基因（ALOX5、TFRC、PHKG2、FADS2、NOX1）表达构建了一个风险评分，并发现该评分可以促进新的治疗方法和指导个体化治疗[6]。然而，尚不清楚该风险评分是否适用于基于CTCs 的预后风险评估。近年来，18F 氟脱氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，FDG）结合正电子发射计算机断层显像/电子计算机X 射线断层扫描技术（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）作为肿瘤代谢负荷的功能成像方法，已成为评估早期治疗反应以及预测包括NSCLC 在内的多种癌症的有前途工具[7]。本研究的主要目的是评估CTCs 铁死亡相关基因构建的风险评分与肿瘤代谢负荷结合用于晚期NSCLC 预后分层的临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选择2019 年1 月至2022 年1 月于唐山市人民医院（唐山市肿瘤医院）接受治疗且病理诊断为Ⅲ～Ⅳ期101 例NSCLC 患者作为研究对象。纳入标准：1）病理诊断为NSCLC；2）接受PET/CT 扫描，并有可用于计算代谢肿瘤体积（metabolic tumor volume，MTV）或糖酵解的总病变（total lesion glycolysis，TLG）水平的数据。排除标准：排除接受过化疗或有任何其他恶性肿瘤病史的患者。本研究获得所有患者或其家属知情同意及本院伦理委员会批准（编号：ED10250）。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 最初的142 例研究受试者中，41 例患者因无法计算MTV 或TLG 水平或风险评分数据不足而被排除，其余101 例患者入选。基线风险评分和PET/CT 扫描之间的测量间隔中位数为7 d[四分位数(IQR)=4～14 d]。中位随访时间为19.4（1.3～36.0）个月。提取并分析关于年龄、性别、美国东部肿瘤协作组体力状况评分（ECOG PS）、吸烟史、病变类型、组织学类型和临床分期的数据。

1.2.2 PET/CT 图像分析 所有患者都在常规临床方案下使用Gemini TF/16 通道PET/CT 扫描仪（购自德国飞利浦医疗系统公司）进行PET/CT 联合扫描。禁食至少6 h 后，静脉注射放射性示踪剂（5～6 MBq/kg）FDG，60 min 后进行扫描。首先采集非增强CT 扫描进行衰减校正，然后采集PET 扫描。通过在PET 图像上使用MIRADA XD3 软件（购自英国MIRADA Medical 公司）绘制感兴趣区域（volume of interest，VOI）来提取标准化摄取值 (standardized uptake value，SUV)、MTV和TLG[8]。将固定的SUV截止值2.5 g/mL用于半自动轮廓绘制系统，以排除非肿瘤组织的生理FDG 吸收。在自动生成VOI 边界后由核医学医生进行手动校正。MTV定义为手动校正VOI 边界内的肿瘤总体积。TLG 计算为MTV 和SUV 平均值的乘积。

1.2.3 基于CTCs 铁死亡相关基因构建的风险评分模型 从每个患者收集外周静脉血样品（3 mL）置于含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的真空采血管中。血液样本暂时储存温度4～10℃，并在24 h 内进行处理。将获得血液样品溶解红细胞并去除白细胞，然后使用CytoploRare 试剂盒（购自上海市GenoSaber Biotech 公司）对叶酸受体阳性的CTCs 进行富集，使用E.Z.N.A.HP 总RNA试剂盒（购自美国OMEGA 公司）提取总RNA。使用PrimeScriptTMRT 试剂盒（购自日本Takara 公司）合成互补DNA（cDNA）。使用IqTMSYBR Green Supermix（购自美国Bio-Rad 公司）进行实时PCR。应用2-△△Ct相对定量方法，通过β-actin 的Ct 值（内源性参照）标准化5 个基因的相对表达水平。实时PCR引物如下：ALOX5 forward：5′-CAAAATCTGGGTG CGTTCCA-3′；ALOX5 reverse：5′-AGCAGCTTGAAA ATGGGGTG-3′；TFRC forward：5′-GGAGTGCTGGA GACTTTGGA-3′；TFRC reverse：5′-TATACAACAG TGGGCTGGCA-3′；PHKG2 forward：5′-AGCTTCGA GAGTTGTGTGGG-3′；PHKG2 reverse：5′-TAACAT CAGGATCTGCCGCC-3′；NOX1 forward：5′-GGGGT CAAACAGAGGAGAGC-3′；NOX1 reverse：5′-CTTC TGCTGGGAGCGGTAAA-3′；FADS2 forward：5′-GC CACTTAAAGGGTGCCTCT-3′；FADS2 reverse：5′-T GCTGGTGATTGTAGGGCAG-3′；β-actin forward：5′-CCACGAAACTACCTTCAATCCC-3′；β-actin reverse：5′-GTGATCTCTCTTCTGCATCCTGT-3′。

参照文献报道的风险评分公式[9]：风险评分=（0.170×ALOX5 表达）+（0.125×TFRC 表达）+（0.298×PHKG2 表达）+（0.181×FADS2 表达）+（0.848×NOX1表达），建立风险评分模型。根据中位风险评分，将患者分为低风险评分组（评分≤0.70，n=51）和高风险评分组（评分＞0.70，n=50）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0 软件进行统计学分析。NSCLC患者的年龄、PET/CT 参数、风险评分数据均表示为中位数和IQR 范围。通过Spearman 相关系数评估风险评分和MTV/TLG 之间的相关性。构建无进展生存 期（progression-free survival，PFS）和总 生存 期（overall survival，OS）的Kaplan-Meier 生存曲线，并通过对数秩检验测量统计学差异。多变量Cox 比例风险模型用于调查风险评分对生存结果影响的风险比（HR），调整的协变量包括年龄、性别、ECOG PS 评分、Charlson 共病指数、临床分期和MTV/TLG 水平。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者风险评分的基线特征

整个队列的年龄中位数为66（58～73）岁，风险评分中位数为0.70（0.40～1.61）。风险评分低和高的患者之间的基线特征相似（表1）。然而，与风险评分低的患者相比，风险评分高的患者表现出明显更高的MTV[49（8～123）mLvs.169（35～498）mL]和TLG 水 平[105（50～290）gvs.415（244～1 330）g]（P＜0.05）。

表1 NSCLC 患者的基线临床病理特征和PET/CT 参数

2.2 风险评分与代谢性肿瘤负荷的相关性

风险评分和MTV、TLG 之间存在显著的正相关（r=0.618、0.462，均P＜0.001）（图1）。

图1 散点图显示NSCLC 患者风险评分与MTV 和TLG 之间的关系

2.3 MTV 或TLG 对风险评分的预后价值

高MTV 的NSCLC 患者表现出相似的中位PFS（低风险评分和高MTVvs.高风险评分和高MTV；4.0 个月vs.3.6 个月；P＞0.05）和中位OS（低风险评分和高MTVvs.高风险评分和高MTV；9.2 个月vs.6.6个月；P＞0.05），与风险评分水平无关。然而，低MTV和低风险评分的患者的中位PFS（低风险评分和低MTVvs.高风险评分和低MTV；16.8 个月vs.7.1 个月；P＜0.001）和中位OS（低风险评分和低MTVvs.高风险评分和低MTV；49.3 个月vs.11.5 个月；P＜0.001）高于低MTV 和高风险评分的患者（图2A，2B）。

图2 根据风险评分、MTV 和TLG 水平对NSCLC 患者的PFS 和OS 进行评估

高TLG 的NSCLC 患者在低和高风险评分水平之间表现出相似的中位PFS（低风险评分和高TLGvs.高风险评分和高TLG；4.0 个月vs.3.2 个月；P＞0.05）。然而，低TLG 和低风险评分患者的中位PFS（低风险评分和低TLGvs.高风险评分和低TLG；16.8 个月vs.5.3 个月；P＜0.001）和中位OS（低风险评分和低TLGvs.高风险评分和低TLG；49.3 个月vs.10.6 个月；P＜0.001）比低TLG 和高风险评分的患者更长。高TLG 和低风险评分水平患者的中位OS 显著长于高TLG 和高风险评分水平的患者（低风险评分和低TLGvs.高风险评分和低TLG；14.1 个月vs.6.6个月；P＜0.05）（图2C，2D）。

2.4 单变量和多变量分析

在单变量分析中，风险评分与不良OS 显著相关（HR=3.03，P=0.001）。多变量Cox 回归分析显示，与低风险评分组相比，高风险评分组OS 的HR 显著增加（HR=3.22，P=0.001）。在多变量分析中调整MTV和TLG 后，NSCLC 患者中高风险评分的HR 相似（P＜0.01，表2）。

表2 NSCLC 患者OS 风险比的单变量和多变量分析

3 讨论

目前，肺癌的早期诊断和预后评估仍然是临床实践中的关键。因此，作为临床肺癌管理的基本策略，18F-FDG PET/CT 检查和对恶性肿瘤患者CTCs 研究不断增加。有研究调查并比较了18F-FDG PET/CT 与CTCs 在肺癌患者中的临床应用，如Bian等[10]报道，在ⅡB～ⅣB 期NSCLC 患者中，CTCs 显示与MTV 相关。Fu 等[11]报道，在ⅢB 期小细胞肺癌治疗前，CTCs的数量与MTV 相关。Castello 等[12]发现较高的MTV和TLG 导致较高的CTCs；NSCLC 患者治疗前后的CTCs 计数变化与肿瘤代谢反应显著相关。根据上述结论，本研究进一步评估了基于CTCs 铁死亡相关基因构建的风险评分对NSCLC 患者OS 的预后价值，证实了风险评分与不良OS 显著相关。

最近，有研究使用多变量Cox 回归分析构建了一个铁死亡相关基因（ALOX5、TFRC、PHKG2、FADS2、NOX1）标记模型预测肺鳞癌患者的预后，并确定风险评分是肺鳞癌的一个独立预后因素，可用于预测肺鳞癌患者1、3 和5 年的OS 概率。高风险评分与免疫浸润增加、较低的甲基化水平、较高的免疫检查点基因水平和较好的化疗药物敏感性相关[9]。TFRC 是一种重要的膜蛋白调节细胞内铁转运蛋白[13]。激活TFRC 增加铁含量，介导ROS 释放，诱导脂质过氧化，进一步促进细胞的铁死亡[14]；然而，敲除TFRC 可通过上调AXIN2 表达或微小RNA-107 海绵显著抑制癌细胞增殖和转移[15]。PhK 是一种异源四聚体，由α、β、γ 和δ 亚基各四个拷贝组成。其中，PHKG2 编码γ 亚基[16]。PHKG2 是多种癌症的诊断生物标志物，包括乳腺癌和子宫内膜癌[17]。NOX1 在ROS 生成和肺癌中起重要作用[18]。有研究发现Toll 样受体4 信号介导NOX1 依赖性ROS 生成增强了NSCLC 的转移[18]。FADS2 在癌症中过度表达，发挥促进癌细胞增殖的作用[19]。抑制FADS2 可以通过增加肺癌细胞中铁和脂质ROS 的水平来减少铁死亡[20]。ALOX5 基因编码脂肪氧合酶，可催化花生四烯酸转化为白三烯[21]。敲除ALXO5 可减轻ARPE-19 细胞的脂质过氧化、线粒体损伤、DNA 损伤和细胞死亡[21]。本研究证实了风险评分与肿瘤代谢负荷相关，即具有较高肿瘤代谢负荷的患者可能具有较高的风险评分。

理论上，利用 PET/CT 扫描的MTV 和TLG水平可以精确估计代谢性肿瘤的负荷[22]。有报道，MTV风险分层系统具有独立于NSCLC 临床分期和其他预后变量的预后价值[7]。因此，本文探讨了结合MTV、TLG 分析和风险评分对NSCLC 的预后价值。本文观察到无论风险评分如何，高肿瘤代谢负荷患者均预后不良。值得注意的是，本研究表明高风险评分患者的预后比低肿瘤代谢负荷合并低风险评分患者差。因此，监测基线风险评分以预测生存可能对低肿瘤代谢负荷的患者至关重要。最后，校正MTV 和TLG 后，在多变量Cox 回归检验中，高风险评分与不良OS 独立相关。因此，基线肿瘤代谢负荷不是风险评分预后的显著混杂因素。

总之，本研究结果表明，监测CTCs 的铁死亡风险评分作为一种早期、可获得的生物标志物来识别低肿瘤代谢负荷的患者，可能有助于改善患者预后。

本文无影响其科学性与可信度的经济利益冲突。