血microRNA-214表达水平与窒息新生儿神经系统预后的初步研究

韦婷艳 何柳芳 韦桂欢 刘付俊业

新生儿窒息是指新生儿在出生时无法启动和维持自主呼吸，出生窒息是一种常见的新生儿健康问题，是新生儿发病和死亡的重要原因[1]。目前关于新生儿窒息的具体病因还未确定，可能与能量代谢衰竭、氧自由基和再灌注损伤、兴奋性氨基酸的毒性作用等密切相关，但也可能与机体内的脑组织炎症反应有关[2]。近年来随着科学的进步，越来越多的研究证实，microRNA（miRNA）参与新生儿窒息的发生发展，其表达的失调与新生儿窒息造成的损伤相关[3]。研究发现，miR-214 在神经元损伤中低表达，高表达的miR-214 可缓解海马神经元的损伤[4]，此外miR-214 在心血管疾病中也扮演重要角色[5]。然而miR-214 是否也参与了新生儿窒息造成的神经功能障碍还未可知。本研究旨在探究miR-214 与窒息新生儿神经系统预后的相关性，以期为新生儿窒息临床治疗提供参考思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象前瞻性连续收集我院2021年3月～2022年3月出生窒息的新生儿30 例（观察组）和同期出生的正常新生儿30 例（对照组）作为研究对象，观察组参照2016年中华医学会围产医学分会新生儿复苏学组制定的新生儿窒息诊断专家共识[6]作出诊断。本研究经深圳市龙华区人民医院伦理委员会批准并获得受试者监护人自愿签署的知情同意书。两组新生儿一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 纳入与排除标准观察组纳入标准：①胎龄37～41+6周的足月儿；②出生体重>2 500g；③出生时有窒息诊断；④出生24h 内入住新生儿科。对照组纳入标准：①胎龄37～41+6周的足月儿；②出生体重>2 500g；③出生时无窒息诊断；④无宫内窘迫史。排除标准：排除患有严重感染、低血糖脑损伤、TORCH 感染、胆红素脑病、中枢神经系统感染、先天畸形及遗传代谢疾病等的新生儿。

1.3 研究方法miR-214表达水平检测方法：所有受试患儿均进行脐带采血（2ml）及出生后3 天、7 天进行外周动脉采血2ml，所有血标本离心（12 000rpm，10min，离心半径10cm）后取血清，提取RNA 后进行定量，然后使用Taq-ManmiRNA Reverse Transcription 试剂盒将定量的RNA 逆转录为模板DNA，以U6 为内参进行RT-qPCR 扩增（95℃预变性10min进行1 个循环，95℃变性15s，60℃复性1min，45 个循环），实验重复3 次，计算△Ct 值，采用2-△△Ct法计算miR-214 的相对表达水平。miR-214 引物序列为F：5'-CAATACTGACAGCAGGCACA-3'，R：5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTAC-3'；U6 引物序列为F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTC ACGAATTTGCGT-3'。项）：头竖立反应（颈屈伸肌）、手握持、牵拉反应、直立支持反应，共8 分；③被动肌张力（4 项）：围巾征、上肢弹回、下肢弹回、腘窝角，共8 分；④原始反射（3 项）：自动踏步、吸吮反射、拥抱反射，共6 分；⑤一般评估（3 项）：觉醒度、哭、活动度，共6 分；5 部分共20 项，总分为40 分；检查工具包括手电筒、格格球和小红球各1 个。评定标准：38～40 分为正常，36～37 分为可疑，35 分及以下为异常。

分析新生儿出生后3 天和7 天的血清miR-214表达水平与NBNA 评分的相关性；分析血清miR-214表达水平与NBNA 评分对窒息新生儿的预后影响；miR-214 水平对新生儿窒息的预测价值。

1.5 统计学方法使用SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较使用t检验；计数资料采用例表示，使用卡方（χ2）检验；重复测量的方差分析比较两组miR-214 水平；采用Pearson 法分析血清miR-214 水平与NBNA 评分相关性；影响因素的确定使用二元Logistic 回归分析；ROC 曲线评估miR-214 水平对新生儿窒息的诊断价值，以P<0.05为差异具有统计学意义。

新生儿行为神经测定（Neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）评分：所有受试患儿均由经过专业培训的人员进行评估，室温在25℃～28℃，保持室内环境安静，在哺乳后1h 进行测定，并在10min 内完成。

2 结果

1.4 观察指标记录两组患儿脐带血、出生后第3天、第7 天血浆miRNA-214表达水平和出生后第3 天、第7 天NBNA 评分。NBNA 评分共包括5 部分：①新生儿行为能力（6 项）：对光的习惯形成、对咯咯声的反应、对说话人脸反应、对咯咯声的习惯形成、对红球的反应、可安慰性（指正在哭闹的新生儿对外界安慰的反应），共12 分；②主动肌张力（4

2.1 两组新生儿血miR-214 水平、NBNA 评分的比较观察组新生儿脐带血、出生后第3 天、第7 天血浆miRNA-214表达水平均低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），同时随着出生时间的推移，血浆miR-214表达水平逐渐降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；观察组新生儿出生后第3 天、第7 天NBNA 评分显著低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），同时观察组新生儿第7 天的NBNA 评分高于第3 天评分，且差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 两组新生儿血miR-214表达及NBNA 评分比较（±s）

表2 两组新生儿血miR-214表达及NBNA 评分比较（±s）

注：与同组脐带血比较，*P<0.05；与同组第3 天比较，#P<0.05

分组例数miR-214 水平NBNA 评分（分）脐带血第3 天第7 天第3 天第7 天对照组300.97±0.280.94±0.271.01±0.1238.31±1.27 38.25±0.89观察组300.77±0.100.51±0.09* 0.38±0.10*#30.60±1.09 34.94±1.30#t 3.6848.27522.09125.23211.507 P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

2.2 血miR-214 水平与NBNA 评分的相关性分析观察组新生儿出生后3 天和7 天的血miR-214表达水平与NBNA 评分均呈显著正相关（P<0.05），见图1。

图1 血miR-214表达水平与NBNA 评分的相关性分析

2.3 窒息新生儿神经预后影响因素分析以是否为窒息新生儿为二分类因变量（赋值0：没有发生窒息，1:发生窒息），并以miR-214 水平和NBNA 评分作为自变量，进行Logistic 回归分析，结果显示，miR-214 水平和NBNA 评分均为新生儿窒息的相关影响因素（P<0.05），见表3。

表3 Logistic 回归分析窒息新生儿神经预后影响因素

2.4 miR-214 水平对新生儿窒息的预测价值ROC曲线分析结果显示，miR-214 水平对新生儿窒息的预测AUC 为0.839；最佳截值为0.633，95%CI为0.732～0.946，其敏感度和特异性分别为90%和73.3%，见图2。

图2 miR-214 水平对新生儿窒息预测价值的ROC 曲线

3 讨论

miRNA 是近年来的研究热点，是一种内源性小非编码RNA，一般由18～24 个核苷酸组成[7]，miRNA 的表达谱已在新生儿窒息疾病中被发现，提示其可能对新生儿窒息发展起重要作用[8]。在人类基因组中，约有700 个miRNAs，主要参与调控细胞分化、代谢、凋亡、血管生成、肿瘤转移和迁移、神经元发育等重要的生物学过程[9，10]。大量实验已证实，miRNA 参与神经细胞的保护及缺血后神经再生的调节，如张赫娱[11]在动物实验中证实，miR-21过表达可增强骨髓间充质干细胞对脑出血大鼠神经功能的恢复。最近的研究发现，miRNA 的差异表达与新生儿窒息相关，可作为早期诊断窒息新生儿神经预后的标志物[12]，但关于miRNA 预测窒息新生儿神经系统的相关报道仍然较少。

本研究发现，窒息组新生儿脐带及出生后3、7 天的血miR-214表达水平分别为（0.51±0.09）和（0.38±0.10），与对照组的（0.94±0.27）和（1.01±0.12）比较均显著降低，同时发现随着时间的推移miR-214表达水平逐渐显著降低，这提示低表达的miR-214 参与了新生儿窒息的发生。窒息可造成新生儿神经系统障碍，威胁患儿生命健康，王姬[13]在研究中发现，miR-214表达的下调参与了幼鼠神经元的凋亡，同时也在动物实验中发现，miR-214 的高表达可与PTEN、Bim 和Bax 蛋白结合进而抑制急性神经细胞凋亡[14]。这些结果提示，miR-214 的差异表达与窒息新生儿神经系统障碍相关。

NBNA 是一种评定新生儿行为的良好指标，可以较全面地反映大脑功能，对神经系统的代偿性恢复具有重要意义，对神经预后及脑神经异常具有重要的临床意义[15]。研究已证实，与正常新生儿比较，窒息新生儿的NBNA 评分降低[16]，本研究中，对照组新生儿出生后第3、7 天NBNA 评分为（38.31±1.27）分和（38.25±0.89）分，窒息组新生儿出生后第3、7 天的NBNA 评分为（30.60±1.09）分和（34.94±1.30）分。与对照组相比，窒息组新生儿NBNA 评分明显下降，提示，窒息组新生儿的神经系统功能下降，陈建涛[16]研究结果中正常患儿的NBNA 评分为（37.16±2.58）分，脑损伤轻度组NBNA 评分为（32.85±2.47）分以及重度组为（28.49±2.46）分，与本研究结果相一致。此外相关性分析发现，窒息组新生儿第3 天和第7 天血清miR-214表达水平与NBNA 评分呈显著正相关，表明miR-214 的表达水平越低，NBNA 评分就越低，由此推测miR-214 水平可能是反映窒息新生儿神经预后的相关指标。进一步以是否为窒息新生儿为二分类因变量做Logistic 回归分析，发现miR-214 水平和NBNA 评分是新生儿窒息的相关影响因素，同时ROC 曲线分析表明，miR-214 水平对窒息新生儿神经预后的预测价值较高，具有较高的敏感度和特异性。

综上，血清miR-214表达水平可较好地反映窒息新生儿神经预后情况，然而本研究仍存在不足之处，如样本量较少等，以及miR-214表达水平对鉴别新生儿窒息严重程度是否同样具有诊断性还不清楚，仍需进一步的实验进行验证。