基于NF-κB/MMP9信号轴研究姜黄素对卵巢癌细胞增殖的抑制作用

吕慧芳 樊真真 汪鋆植 黄晓飞 刘正泰

卵巢癌是妇科肿瘤中最常见的一种疾病[1]，目前卵巢癌早期筛查手段有限[2]，大多数患者确诊时已是晚期[3]，预后差，5年生存率较低。随着治疗手段的不断进步和发展，虽然手术、放化疗、PARP 抑制剂和免疫治疗等对卵巢癌的治疗效果较好[4]，但是对于晚期伴有转移的卵巢癌患者并不能降低其死亡率。因此，探讨卵巢癌的发病机制，提高患者的生存质量，是卵巢癌研究的必然趋势。卵巢癌的发生与免疫、内分泌和肿瘤微环境等多种因素相关[5，6]，核因子-κB（NF-κB）作为一种核转录因子，参与乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌等多种肿瘤的发生发展，特别是与肿瘤的血管生成、侵袭转移密切相关[7，8]，NF-κB 的持续活化可以作为多种肿瘤发生发展的一种诊断参考，基质金属蛋白酶9（MMP9）是NF-κB 的重要靶基因，参与肿瘤的血管生成、侵袭转移、免疫调节等多种生理病理过程[9]。NF-κB/MMP9信号轴对研究卵巢癌具有重要意义，因此，本研究基于NF-κB/MMP9信号轴探讨姜黄素对卵巢癌细胞的影响及作用机制，为进一步寻找治疗卵巢癌的方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株及药物卵巢癌SKOV3 细胞株购自中科院上海细胞库，姜黄素购自川泽科技有限公司，二甲基亚砜（DMSO）溶解姜黄素粉末。

1.2 试剂1640 培养基粉、进口胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco 公司）；噻唑蓝（MTT，Amresco 公司）；β-actin、p-NF-κB、MMP9 单克隆抗体（美国CST 公司）；荧光定量PCR 试剂盒、RNA 提取试剂盒、cDNA 反转录试剂盒（Thermo Fisher 公司）；LDH 检测试剂盒购自碧云天生物技术公司，其他试剂均为标准分析纯试剂。

1.3 实验仪器倒置显微镜、酶联免疫检测仪（Thermo 公司）；超净工作台（苏州净化设备仪器有限公司）；CO2培养箱（Shelljb 公司）；台式低速离心机（北京京立离心机有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 体外细胞培养 将SKOV3 细胞接种于1640培养基中（含10%胎牛血清），置于饱和湿度的培养箱（5%CO2、37℃）培养，待细胞贴壁85%左右后，用0.25%胰酶消化细胞，每3～4 天传代，使细胞密度维持在85%左右，取对数生长期细胞进行实验。

1.4.2 LDH 实验检测姜黄素对SKOV3 细胞的毒性细胞贴壁85%左右后，用0.25%胰酶消化细胞，制成5×104/ml 细胞混悬液，以每孔200μl 将SKOV3细胞接种于96 孔板中，待细胞生长稳定后，随机将SKOV3 细胞分为姜黄素组、对照组（未经药物处理的、用于后续裂解的样品最大酶活性组）和阴性细胞组（背景空白组），姜黄素组换用终浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L 和40μmol/L 的姜黄素培养液。继续培养24h 和48h，根据试剂盒操作说明书，加入LDH 检测工作液，490nm 处测定吸光度（OD），并且计算姜黄素对细胞的毒性。细胞毒性=（OD药物处理组-OD阴性细胞组）/（OD对照组-OD阴性细胞组）×100%。

1.4.3 MTT 法检测SKOV3 细胞活性 同方法培养细胞后，随机将SKOV3 细胞分为姜黄素组和对照组，姜黄素组分别用浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L 的姜黄素培养液，对照组加入等量的1640 培养液。继续培养24h、48h 后，MTT 法检测SKOV3 细胞的OD 值，并使用计算软件计算SKOV3细胞的IC50值。

1.4.4 RT-PCR 检测NF-κB、MMP9 的mRNA 表达水平 取待用的细胞接种于96 孔板中，随机分为姜黄素组和对照组，姜黄素组分别给予浓度为10μmol/L、20μmol/L 的姜黄素培养液，对照组加入等量的1640 培养液。继续培养24h 和48h 后，提取细胞内总RNA，按照试剂盒说明书转录合成cDNA，并进行RT-PCR 分析。采用2-△△Ct法计算NF-κB 和MMP9 mRNA 相对表达水平。在PubMed 中查找目的基因的NCBI GeneID，然后在PrimerBank 中查找GeneID 对应的引物序列，并在NCBI 中验证引物的特异性。

β-actin：上游引物为5'-TCCTGTGGCATCCAC GAAACT-3'，下游引物为5'-GAAGCATTTGCGGTG GACGAT-3'；NF-κB：上游引物为5'-GGTGCGGCT CATGTTTACAG-3'，下游引物为5'-GATGGCGTCT GATACCACGG-3'；MMP9：上游引物为5'-AGACCT GGGCAGATTCCAAAC-3'，下游引物为5'-CGGCAA GTCTTCCGAGTAGT-3'。

1.4.5 Western blot 检测NF-κB、MMP9 蛋白表达水平 将SKOV3 细胞接种于培养瓶中，随机分为姜黄素组和对照组，姜黄素组分别给予10μmol/L 和20μmol/L 姜黄素培养液，对照组加入等量的1640培养液。继续培养24h 和48h，收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，电泳分离各蛋白，并将目的蛋白转到PVDF 膜上，在封闭液中封闭PVDF 膜2h，分别加入β-actin、NF-κB 和MMP9单克隆抗体，经过孵育和洗膜后，加入二抗孵育1.5h，使用显影仪显影。用ImageJ 软件对目的蛋白表达情况进行分析。

1.5 统计学分析实验数据采用SPSS 19.0 和ImageJ软件进行分析。计量资料用±s表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对SKOV3 细胞毒性的影响与对照组相比，随着剂量的增加，姜黄素对SKOV3 细胞的毒性增强，并具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 不同浓度姜黄素对SKOV3 细胞的相对毒性（±s，n=3）

表1 不同浓度姜黄素对SKOV3 细胞的相对毒性（±s，n=3）

注：与对照组相比，aP<0.05，bP<0.01；与5μmol/L 姜黄素组相比，dP<0.01

分组24h（%）48h（%）对照组1.00±0.060.97±0.06 5μmol/L 姜黄素组1.06±0.070.98±0.03 10μmol/L 姜黄素组1.28±0.23a1.32±0.17a 20μmol/L 姜黄素组1.41±0.09bd1.63±0.04bd 40μmol/L 姜黄素组2.08±0.10bd2.58±0.34bd F 35.45044.413 P<0.001<0.001

2.2 姜黄素对SKOV3 细胞增殖的影响与对照组相比，姜黄素对SKOV3 细胞的生长具有抑制作用，随着剂量的增加其抑制作用增强，并具有剂量依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。通过姜黄素的OD 值，计算得出姜黄素作用于SKOV3细胞24h 的IC50值为34.5μmol/L，48h 的IC50值为28.6μmol/L。见表2。

表2 不同浓度姜黄素对SKOV3 细胞增殖的影响（±s，n=3）

表2 不同浓度姜黄素对SKOV3 细胞增殖的影响（±s，n=3）

注：与对照组相比，aP<0.01；与5μmol/L 姜黄素组相比，bP<0.01

分组OD 值24h48h对照组0.86±0.040.84±0.03 5μmol/L 姜黄素组0.86±0.010.82±0.02 10μmol/L 姜黄素组 0.77±0.01ab 0.62±0.02ab 20μmol/L 姜黄素组 0.60±0.03ab 0.50±0.02ab 40μmol/L 姜黄素组 0.47±0.04ab 0.40±0.03ab F 120.342174.672 P<0.001<0.001

2.3 姜黄素对SKOV3 细胞NF-κB、MMP9 mRNA表达水平的影响根据细胞毒性实验和细胞增殖抑制实验结果，随着姜黄素浓度增加，姜黄素对SKOV3 细胞的毒性和抑制作用增强，SKOV3 细胞的生长状况变差，根据蛋白的预实验结果，综合考虑，因此选择10μmol/L、20μmol/L 姜黄素进行蛋白和mRNA 的检测。RT-PCR 结果显示，与对照组相比，在10μmol/L 时，姜黄素可以显著抑制SKOV3 细胞中MMP9 mRNA 的相对表达，姜黄素作用24h 对NF-κB mRNA 的表达基本无影响，作用48h 可以显著抑制NF-κB、MMP9 mRNA 表达；在20μmol/L 时，姜黄素可以显著抑制NF-κB、MMP9 mRNA 的表达，姜黄素对NF-κB、MMP9 mRNA 的影响具有剂量依赖性，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 不同浓度姜黄素对SKOV3 细胞NF-κB、MMP9 mRNA 相对表达的影响（±s）

表3 不同浓度姜黄素对SKOV3 细胞NF-κB、MMP9 mRNA 相对表达的影响（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与10μmol/L 姜黄素组相比，cP<0.05，dP<0.01

分组24h48h NF-κBMMP9NF-κBMMP9对照组0.99±0.02 0.99±0.081.00±0.12 1.01±0.12 10μmol/L姜黄素组0.96±0.01 0.67±0.07b 0.77±0.13a 0.54±0.14b 20μmol/L姜黄素组 0.84±0.04bd 0.56±0.02bc 0.46±0.10bc 0.31±0.07bc F 28.89638.36516.58935.400 P<0.001<0.001<0.001<0.001

2.4 姜黄素对SKOV3 细胞p-NF-κB、MMP9 蛋白表达的影响Western blot 结果显示，与对照组相比，在10μmol/L 时，姜黄素可以显著抑制MMP9 蛋白的表达，姜黄素作用24h 对p-NF-κB 蛋白的表达基本无影响，作用48h 可以显著抑制p-NF-κB、MMP9 蛋白表达；在20μmol/L 时，姜黄素可以显著抑制p-NF-κB、MMP9 蛋白表达，姜黄素对p-NFκB、MMP9 蛋白的影响具有剂量依赖性，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1、表4。

表4 不同浓度姜黄素对SKOV3 细胞中p-NF-κB、MMP9蛋白相对表达的影响（±s，n=3）

表4 不同浓度姜黄素对SKOV3 细胞中p-NF-κB、MMP9蛋白相对表达的影响（±s，n=3）

注：与对照组比较，aP<0.01；与10μmol/L 姜黄素组相比，bP<0.01

分组24h48h p-NF-κB MMP9p-NF-κB MMP9对照组0.83±0.04 0.90±0.020.46±0.01 0.98±0.02 10μmol/L姜黄素组0.85±0.02 0.62±0.02a 0.35±0.01a 0.72±0.01a 20μmol/L姜黄素组0.65±0.04ab 0.28±0.01ab 0.03±0.01ab 0.06±0.01ab F 27.703756.6343354.0032854.334 P<0.001<0.001<0.001<0.001

图1 不同浓度姜黄素作用24h、48h 时SKOV3 细胞中p-NF-κB、MMP9 蛋白表达水平

3 讨论

姜黄素是从姜黄中提取的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和清除自由基等多方面的药理作用[10]，应用价值较高。姜黄素的开发应用主要集中在保肝、抗炎方面，近年来对姜黄素在肿瘤方面的研究引起广泛关注，有多项研究表明，姜黄素可抑制乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的增殖[11～14]。姜黄素抑制癌细胞增殖是多信号通路参与的过程[13～16]，因此对姜黄素在肿瘤方面的不断研究，为姜黄素的进一步开发利用提供依据。

NF-κB 通路参与癌症发生发展的侵袭转移、自噬凋亡、血管生成及炎症等多种病理过程[17]，并且与肿瘤微环境的形成以及药物的耐药密切相关。已有研究表明，NF-κB 的下调能够抑制卵巢癌细胞的生长和迁移[18]，姜黄素通过激活AMPK、抑制NF-κB 和MMP9 来抑制结肠癌细胞的侵袭[19]。姜黄素通过调节NF-κB 和JAK2/STAT3 信号通路减轻急性肾损伤的炎症和细胞凋亡[20]。姜黄素能够抑制SKOV3 细胞的侵袭和迁移，促进卵巢癌细胞的自噬和凋亡[21，22]，从而达到治疗卵巢癌的目的。孙桂霞等[23]研究发现姜黄素抑制卵巢癌细胞的增殖具有时间与浓度依赖性。以上研究结果表明，姜黄素对多种肿瘤细胞具有抑制作用，本研究结果表明，姜黄素对SKOV3 细胞的毒性增强，并具有剂量依赖性，姜黄素可以显著降低卵巢癌SKOV3 细胞的存活率，并具有剂量依赖性，与上述结果一致。

已有研究表明MMP9 与肿瘤细胞的迁移、血管的生成以及转移的发生密切相关[24]，MMP9 既具有促肿瘤活性又具有肿瘤抑制功能，MMP9 的表达水平与癌症的侵袭转移及不良预后密切相关。姜黄素能够抑制小鼠宫颈癌皮下移植瘤模型外周血和肿瘤组织MMP2、MMP9、VEGF 的表达[25]。姜黄素联合紫杉醇能够抑制乳腺癌MDA-MB-231 细胞迁移侵袭能力，姜黄素能够降低裸鼠移植瘤组织中MMP9 蛋白和mRNA 的表达[26]。本研究结果表明，与对照组相比，姜黄素以剂量依赖的方式显著降低p-NF-κB 和MMP9 蛋白表达，NF-κB 和MMP9 mRNA 的相对表达水平与蛋白表达结果相一致，提示姜黄素可能通过抑制NF-κB/MMP9信号轴，进而抑制卵巢癌细胞的增殖，可能是治疗卵巢癌的潜在药物。

综上所述，姜黄素可能通过抑制NF-κB/MMP9通路抑制卵巢癌细胞的增殖，对卵巢癌有一定的疗效，由于姜黄素具有多种药理作用且其作用机制复杂、本身固有的理化性质等多种因素的影响，姜黄素在体内外的抗肿瘤作用还有待于临床进一步研究。