Survivin、IMP3及Claudin1在浆膜腔积液细胞蜡块中的表达及临床意义

韩永良 汪亮亮 王洁 赵锐

浆膜腔积液病因复杂，良恶性疾病均可引起。其中恶性肿瘤侵袭或转移引起浆膜腔积液约占15%～20%[1]。目前细胞学是诊断浆膜腔积液良恶性的金标准，但敏感度仅为60%[2]，而且易受病理医师主观因素影响。常用肿瘤标记物甲胎蛋白（AFP）、糖类抗原（CA）125、CA199 及角蛋白（CK）等在恶性转移癌及良性间皮细胞增生之间的鉴别作用有限[3]。本研究利用免疫组化方法检测浆膜腔积液细胞蜡块中Survivin 、IMP3 及Claudin1 的表达情况，综合分析其在良恶性浆膜腔积液中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集我院2017年2月～2021年11月行细胞蜡块及免疫组化检查且临床资料完整的浆膜腔积液细胞学标本共计95 例，其中恶性浆膜腔积液84 例，良性11 例。所有患者均未进行放化疗。

1.2 试剂所用试剂Survivin、Claudin1 及IMP3（克隆号EP286）以及二抗均购自福建迈新生物技术有限公司。

1.3 方法将所有浆膜腔积液标本放置4℃冰箱内静止30min 以上，倒掉上清液留沉淀部分约100ml，分别装入2 个50ml 离心管中，2 000r/min 离心5min，除去上清液，留取细胞沉渣。若细胞成分较少，则加入95%乙醇震荡混匀，再次2 000r/min 离心3min，静置40min，除去上清液，然后加入10%中性福尔马林缓冲溶液固定2h，取出凝固成块细胞沉淀物，纱布包裹放入包埋盒中常规脱水、包埋、切片、染色[4]。根据肿瘤来源分为肺腺癌组（n=41）、消化系统腺癌组（n=25）、卵巢恶性肿瘤组（n=9）以及其他恶性肿瘤组（n=9）。良性标本为对照组，免疫组化采用EnVision 两步法，在BOND-MAX 自动免疫组化染色仪上进行，具体操作按试剂说明书进行。

1.4 判读标准Survivin、IMP3 及Claudin1 蛋白的表达以肿瘤细胞胞浆和（或）胞核内出现明显棕黄色颗粒为阳性反应。计数 500 个肿瘤细胞中的阳性细胞数量，阳性细胞数<1%计为阴性、1%～25%为“+”、>25%～50%为“++”、>50%为“+++”，结果由两名高级职称的病理医师在双盲情况下观察确定。

1.5 统计学方法应用SPSS 23.0 统计软件进行统计分析，各组间Survivin、IMP3 及Claudin1 蛋白的表达采用卡方检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征84 例恶性浆膜腔积液患者年龄29～86 岁，男41 例，女43 例。胸腔积液53 例，腹腔积液31 例。其中来源于肺腺癌41 例、消化系统腺癌25 例、卵巢恶性肿瘤9 例、其他恶性肿瘤9 例。其中胸腔积液内，37 例（69.81%）来源于肺腺癌，5例来源于消化系统腺癌，9 例来源于其他恶性肿瘤，2 例卵巢恶性肿瘤。腹腔积液内20 例（65.51%）来源于消化系统腺癌，7 例来源于卵巢恶性肿瘤，4 例来源于肺腺癌。

2.2 浆膜腔积液细胞学形态肺腺癌肿瘤细胞异型性明显，细胞核大、深染，可见一个或几个核仁，部分细胞核偏位，胞浆丰富，部分胞浆内可见空泡。呈腺样、乳头状或单个散在排列（见图1）。消化系统腺癌肿瘤细胞体积较大，细胞界限不清，核偏位或位于胞体边缘，核膜不规则，染色质深染，可见大核仁，胞浆多空泡状，呈团或单个排列，部分病例可见黏液（见图2）。卵巢恶性肿瘤与肺腺癌及消化系统腺癌细胞学形态相似，细胞异型性明显，核浆比增大，细胞核空泡状，核仁可见，呈乳头样、桑葚样排列（见图3）；肺小细胞癌肿瘤细胞体积较小，大小较一致，胞浆稀少，染色质细腻，椒盐状，呈列兵状或镶嵌状排列（见图4）。

图1 肺腺癌细胞形态

图2 消化系统腺癌肿瘤细胞形态

图3 卵巢恶性肿瘤细胞形态

图4 肺小细胞癌肿瘤细胞形态

2.3 各组 IMP3 蛋白的表达情况IMP3 定位于细胞浆，呈棕色颗粒状（见图5）。肺腺癌组IMP3 阳性率为46.34%（19/41），消化系统腺癌组阳性率为44.00%（11/25），卵巢恶性肿瘤组阳性率为33.33%（3/9），其他恶性肿瘤组阳性率为22.22%（2/9），对照组阳性率为9.10%（1/11）。肺腺癌组及消化系统腺癌组与对照组相比，差异具有统计学意义（χ2=5.085、4.189，P=0.035、0.043），而卵巢恶性肿瘤组及其他恶性肿瘤组IMP3 的表达情况与对照组相比，差异无统计学意义（χ2=1.181、0.669，P=0.285、0.421）。

图5 肿瘤细胞IMP3 弥漫强阳性表达（EnVision 两步法）

2.4 各组Claudin1 蛋白的表达情况Claudin1 主要定位于细胞浆，呈棕色颗粒状（见图6）。肺腺癌组Claudin1 阳性率为36.59%（15/41）、消化系统腺癌组阳性率为56.00%（14/25）、卵巢恶性肿瘤组阳性率为55.56%（5/9）、其他恶性肿瘤组阳性率为22.22%（2/9），对照组阳性率为18.18%。消化系统腺癌组与对照组相比，差异具有统计学意义（χ2=4.425，P=0.039），肺腺癌组、卵巢恶性肿瘤组及其他肿瘤组与对照组相比，差异无统计学意义（χ2=1.335、3.039、0.052，P=0.304、0.160、0.625）。

图6 肿瘤细胞Claudin1 弥漫强阳性表达（EnVision 两步法）

2.5 各组Survivin 蛋白的表达情况Survivin 定位于细胞核（见图7）。肺腺癌组Survivin 阳性率为24.39%例（10/41），消化系统腺癌组阳性率为12.00%（3/25），卵巢恶性肿瘤组、其他恶性肿瘤组及对照组阳性率均为22.22%（2/9），各组与对照组相比，差异均无统计学意义（χ2=1.217、0.065、0.669、0.669，P=0.204、0.430、0.347、0.347）。

图7 肿瘤细胞Survivin 阳性表达（EnVision 两步法）

3 讨论

浆膜腔积液在临床上常见，有时甚至是患者的唯一症状。并且标本容易获取，对患者创伤小，尤其适合年老体弱并且无法获得活检组织的患者。细胞学不仅可以判断其良恶性，还可利用免疫组化及分子寻找来源，对治疗及预后有重要的临床意义[5～7]。随着免疫组化在细胞块中的应用，部分肿瘤细胞的来源及良恶性可确定，但在恶性肿瘤及间皮细胞间的鉴别作用有限。有研究显示，胸腔积液中男性81.8%来源于肺腺癌，女性则60%来源于肺腺癌，25%来源于乳腺癌；在腹腔积液中男性最常见来源为胃肠道肿瘤（60%），女性则63.3%来源于卵巢恶性肿瘤[8]。本研究显示，胸腔积液中，69.81%来源于肺腺癌，少部分来源于其他恶性肿瘤。腹腔积液中65.51%来源于消化系统腺癌，与上述报道相符。

Survivin 作为抗凋亡蛋白（IAP）家族中最小的成员，是由BIRC5 基因（杆状病毒）编码的蛋白，定位于17q25 号染色体上，N'端与C'端通过BIR 区域关联形成双螺旋结构，这个区域在染色体的形成和相互作用中起重要作用，特别是在细胞的有丝分裂过程中作用重大[9]。并且对于癌细胞上皮-间质转化有调控作用，使上皮恶性肿瘤细胞突破基底膜组织的能力增加[10]。有研究显示在卵巢癌转移风险较高的患者病灶中Survivin 蛋白的阳性率约为65%，明显高于转移风险较低的卵巢癌患者，并且Survivin 的表达情况能够影响到临床分期及组织分化程度[11]。本研究显示，卵巢恶性肿瘤组织Survivin阳性率与其他恶性肿瘤组阳性率比较差异无统计学意义。

IMP3 是一种与多种肿瘤相关的胎儿蛋白，胰岛素样生长因子ⅡmRNA 结合蛋白家族包括：IMP1、IMP2 及IMP3。IMP3 蛋白基因位于人类染色体7p11.5，编码相对分子质量为6.5×104的RNA 结合蛋白[12]。与IGF-ⅡmRNA 的5'端非编码区相结合，激活多条细胞信号通路，从而促进IGF-Ⅱ的翻译，使其蛋白表达水平上调，最终导致肿瘤细胞的增殖。IMP3 正常存在于胚胎早期阶段，在发育中的肌肉和胎盘及上皮组织可有所表达，但在正常成人体的组织内几乎不能被检测到[13]。大量研究显示IMP3 可在人类多种恶性肿瘤中表达，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌及胃肠道癌，并且与预后有关[14，15]。另有研究发现，IMP3 可用于腹膜恶性肿瘤及间皮反应性增生中，并且与增殖指数密切相关，此外与年龄、性别及组织学类型有关[16]。本研究显示，卵巢恶性肿瘤组及其他恶性肿瘤组与对照组的IMP3 阳性率相比，差异无统计学意义，但其阳性率（33.33%、22.22%）还是高于对照组（9.10%）。因此，IMP3 是鉴别良性及恶性浆膜腔积液的一个比较可靠的指标。

正常组织的细胞之间主要依靠紧密连接复合体来维持细胞之间的黏附性及细胞的极性。而恶性肿瘤则失去正常细胞之间的黏附性及极性，从而导致肿瘤细胞生长不受控制，致使肿瘤细胞具有侵袭性，且更容易出现转移[17]。细胞之间的紧密连接是由一些紧密连接带组成，构成紧密连接的蛋白主要有Claudin 1、occludin、ZO-1、ZO-2、ZO-3、cingulin 及MUPP1 等[18]，其中最重要的为Claudin 1、occludin。Claudin 1 蛋白是由相对分子量25 000～27 000 的蛋白组成，主要由CLDN 基因家族编码，在哺乳动物中由 27 个成员组成[19]。Claudin 1蛋白是通过二级结构之间的相互作用来维持细胞与细胞之间的紧密连接作用。Claudin 1 蛋白的异常表达说明细胞之间的紧密连接功能失常，从而导致肿瘤的发生及转移，目前，研究显示Claudin 1蛋白在乳腺癌、肝癌、肺癌、肠癌等都有表达[20～22]。Huang 等[23]研究发现，Claudin1 在胃癌中可能是通过调节TNF-α 诱导的基因表达从而影响肿瘤迁移等。本研究显示，消化系统腺癌组Claudin1 阳性率最高，并且与对照组相比差异具有统计学意义，其他各组阳性率也明显高于对照组，特别是卵巢恶性肿瘤组，因此Claudin1 在良恶性肿瘤中也可作为一个潜在的免疫标记物。

综上，IMP3、Claudin1 蛋白对浆膜腔积液良恶性及肿瘤来源具有鉴别意义，尤其是IMP3 在诊断消化系统腺癌或肺腺癌来源时可作为一个可靠指标，Claudin1 可作为诊断肺腺癌来源的免疫标志物，而Survivin 对浆膜腔腔积液良恶性及恶性肿瘤来源无鉴别意义。