三株新型海参致病菌的分离鉴定及特性分析

许潇冉，葛长字，张玉群，刘洪展

（1.昌吉州市场监督管理局产品质量检验所，新疆 昌吉 831100；2.山东大学海洋学院近海生态动力学实验室，山东 威海 264209）

仿刺参（Apostichopus japonicus）属于棘皮动物门（Echinodermata）海参纲（Holothuroidea）仿刺参属（Apostichopus），是世界各地海底常见的海洋无脊椎动物。海参作为传统滋补类海产品，由于其含有大量的生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、提高免疫力等多种医疗保健功能［1，2］，在亚洲受到消费者的青睐。仿刺参作为重要的水产养殖品种，在中国、日本、俄罗斯和韩国等亚洲地区广泛养殖［3］。自20 世纪80 年代以来，仿刺参已成为中国海水养殖业中最大的养殖品种［4］，然而腐皮病的频发严重制约了海参健康养殖业的发展。

仿刺参于2017 年7 月购自山东省威海市世昌大道水产批发市场，在实验室人工饲养过程中，皮肤出现溃烂，引发较严重的死亡现象。患病仿刺参表现出皮肤呈现白色、点状溃烂、吸附力下降、停止进食等现象。本研究将病原菌从仿刺参皮肤溃烂组织分离纯化，通过人工回接感染试验验证其致病性，并通过形态学观察、生化鉴定、16S rRNA 分子鉴定、药物敏感性分析、生长特性分析等方法对分离菌株进行鉴定，以期为仿刺参腐皮病的预防和治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

活体仿刺参购自山东省威海市世昌大道水产批发市场，体长（6±0.32）cm，重（25±0.60）g，病原菌分离自养殖过程中仿刺参皮肤溃烂病灶组织。实验室养殖仿刺参所用海水取自威海海水浴场，用静置沉淀48 h 后的天然陈海水养殖仿刺参。暂养条件为温度（14±2）℃，连续充氧，每天换海水。

1.2 试验试剂

药敏片、葡萄球菌生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，革兰氏染色试剂盒购自珠海贝索生物有限公司，PCR MasterMix 购自青岛派森诺生物科技有限公司，16S rDNA 通用引物27F 和1492R 由青岛派森诺生物科技股份有限公司合成。2216E 培养基购自威海新月化玻仪器技术有限公司。

1.3 病原菌分离纯化

取仿刺参腐皮病病灶组织，剪碎后用灭菌磷酸缓冲液悬浮，将悬浮液分别稀释1、10、100倍，分别涂布于2216E 固体培养平板上。28 ℃培养24 h后，挑取不同形态的单菌落分别划线，直到获得纯化的细菌后挑单菌落于LB 液体培养基摇菌，加50%甘油保菌，存于-20 ℃冰箱中。最后得到3 株优势致病菌，分别命名为WY-8、LY-2 和WY-1。

1.4 人工回接感染试验

富集3种菌液各200 mL，离心弃上清，PBS重悬，得到重悬菌液，测定540 nm 处吸光度，调整稀释后注射，注射攻毒数量级（浓度）为6.72×107CFU/mL，注射后观察仿刺参未出现吐肠等应激行为。

1.5 病原菌种属特征鉴定

将纯化后的单菌落转移至装有20 μL 去离子水的PCR 小管中，99 ℃破壁20 min。反应体系为H2O，21 μL；模板DNA，3 μL；正向引物，3 μL；反向引物，3 μL；Long mix（2×），30 μL。引物序列1492R 为CTACGGCTACCTTGTTACGA 3′，27F 为5′ AGAGTT TGATCCTGGCTCAG 3′。扩增条件为：95 ℃变性，5 min；94 ℃变性，30 s；58 ℃复性，70 s；72 ℃延伸，45 s；72 ℃延伸，10 min；-20 ℃保存。PCR 结束后取5 μL PCR 产物于1%琼脂糖凝胶中电泳30 min，检测是否有条带。若有条带出现，将剩余55 μL PCR产物递交青岛派森诺生物公司进行16S rRNA 测序［5，6］。将16S rRNA 测序结果在NCBI 和EzBioCloud数据库进行比对，在EzBioCloud 数据库下载相应序列，用Mega7.0 构建Neighnor-joining 系统发育树，并通过Bootstrap 法（1 000 次重复）检验［7］。在Genbank中利用Bankit 在线注册提交，按照提示，获得3 株致病菌Genbank 序列号。生化鉴定和革兰氏染色严格按照试剂盒中说明书要求操作。

1.6 病原葡萄球菌特性分析

为研究3 株仿刺参病原葡萄球菌的生长特性，设置不同的温度、盐度、pH 梯度，初始菌液浓度相同的条件下，观察葡萄球菌的生长状况，设置温度（14、18、21、24、27、30、33、36 ℃）、盐度（3‰、11‰、19‰、25‰、35‰）、pH（4.5、6.0、6.5、9.0）。

1.7 药物敏感性试验

本研究中抗生素选用依据：土霉素和四环素为海洋水产疾病防治中的常用抗生素，配制0.2 mol/L土霉素溶液和0.1 mol/L 四环素溶液，用0.22 μm 滤器过滤除菌。在超净工作台内，将菌液稀释50 倍后分别涂布，再将灭菌的药敏片分别置于菌液涂布后的2216E 平板上，每个平板4 个药敏片，每个药敏片上滴加7 μL 抗生素药品溶液，使药品完全浸透药品片却不溢出。48 h 后观察测量抑菌圈直径大小。

1.8 数据处理方法

利用SPSS19.0、MEGA7.0 和Excel软件进行数据处理与作图分析。

2 结果与分析

2.1 人工回接感染

人工回接感染仿刺参染病死亡率的统计情况见表1。由表1 可知，WY-8、LY-2、WY-1 三株菌对仿刺参的致死率分别为81%、63%、54%。再次回接感染后仿刺参染病症状与首次自然染病状态高度相似，表现为斑点状溃烂，WY-8 溶血葡萄球菌感染组溃烂较为严重，LY-2 表皮葡萄球菌和WY-1 腐生葡萄球菌感染组症状相似，发生轻微溃烂。将感染后的仿刺参皮肤溃烂组织进行细菌再分离，经16S rRNA 分子鉴定，病原与首次分离鉴定的结果相同，符合柯赫氏法则，因此WY-8、LY-2、WY-1 为仿刺参腐皮病致病菌。

表1 人工回接感染仿刺参染病死亡率

2.2 种属鉴定结果

生化鉴定结果见表2。由表2 可知，LY-2 可利用蔗糖和尿素，WY-1 可利用果糖、麦芽糖和尿素，WY-8 可利用麦芽糖、甘露醇和尿素，3 株病原菌革兰氏染色呈阳性。凝胶电泳检测显示16S rRNA PCR 产物条带清晰，将PCR 产物送至青岛派森诺生物公司测序，16S rRNA 基因测序质量良好。将LY-2、WY-1 和WY-8 的测序序列在NCBI 中分别进行比对，与已报道的某些表皮葡萄球菌（S.epidermidis）、腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）、溶血葡萄球菌（S.haemolyticus）的16S rRNA 基因核苷酸同源性≥99%。进一步将WY-8、WY-1、LY-2的16S rRNA 测序结果在EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）数据库进行比对，分别与模式菌株为MTCC3383（S.haemolyticus）、ATCC15305（S.saprophyticus）、ATCC14990（S.epidermidis）的相似度依次为99.93%、100.00%、98.62%。在EzBioCloud 数据库 下载序列，用MEGA7.0 构建N-J 系统发育树（图1），由图1 可知，LY-2与S.epidermidis（ATCC14990）聚为一支，置信度为96；WY-1与S.saprophyticus（ATCC15305）聚为一支，置信度 为100；WY-8与S.haemolyticus（MTCC3383）聚为一支，置信度为99。初步判断WY-1、WY-8 和LY-2 分别为腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌。在Genbank 中利用Bankit注册并在线提交序列后，获得Genbank 注册号分别 为WY-8，MH 930438；WY-1，MH 930439；LY-2，MH930441。

图1 菌株WY-1、WY-8、LY-2 在葡萄球菌系统发育中的地位

表2 生化鉴定结果

2.3 生长特性分析

2.3.1 时间变化对细菌生长的影响 如图2 所示，3株葡萄球菌在24 h 内随时间延长不断增长，后达到平台期，说明时间变化对3 株菌生长均有显著影响（P＜0.05）。

2.3.2 不同盐度对细菌生长的影响 由图3 可知，盐度变化对3株葡萄球菌生长有显著影响（P＜0.05），溶血葡萄球菌和表皮葡萄球菌随盐度增长，生长曲线呈不断下降的趋势，腐生葡萄球菌随盐度增长呈先升高后下降的趋势。表皮葡萄球菌最适盐度为3‰；溶血葡萄球菌最适盐度为3‰；腐生葡萄球菌最适盐度为19‰。

图3 不同盐度对细菌生长的影响

2.3.3 不同温度对细菌生长的影响 由图4 可知，温度变化对3株葡萄球菌生长有显著影响（P＜0.05），随着温度升高，3 株葡萄球菌的生长曲线均呈先升高后降低的变化趋势。腐生葡萄球菌最适生长温度为36 ℃；表皮葡萄球菌最适生长温度为33 ℃；溶血葡萄球菌最适生长温度为33 ℃。

图4 不同温度对细菌生长的影响

2.3.4 不同pH 对细菌生长的影响 由图5 可知，pH变化对3 株葡萄球菌生长有显著影响（P＜0.05），随着pH 升高，3 株葡萄球菌的生长曲线都呈先升高后降低的趋势，峰值即最适pH 均为6.0。

图5 不同pH 对细菌生长的影响

2.4 药敏试验结果

由图6 可知，四环素处理下，3 株菌的抑菌圈半径大小依次为溶血葡萄球菌＞腐生葡萄球菌＞表皮葡萄球菌；土霉素处理下，3 株菌的抑菌圈半径大小依次为溶血葡萄球菌＞表皮葡萄球菌＞腐生葡萄球菌。如图7 所示，药敏片周围的抑菌圈透明度较高，可以看出抗生素对细菌的生长具有有效的抑制作用。

图6 不同抗生素对菌株的影响

图7 四环素（左）和土霉素（右）对葡萄球菌生长的抑制作用

3 讨论

仿刺参养殖业的迅速发展引起人们的关注，随着养殖规模的不断扩大，仿刺参腐皮病现象频发。研究报道可引起仿刺参腐皮病的主要致病微生物有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）［8］、灿烂弧菌（Vibrio splendidus）［9，10］、假互单胞菌（Pseudomonassp.）［11］、病毒（Viruses）［12］、希瓦氏菌（Shewanella）［13］和乳球菌（Lactococcus garviaeae）［14］。

本研究从仿刺参皮肤溃烂组织中分离得到的3株优势致病菌，通过人工回接感染试验，3 株菌确定为仿刺参腐皮病致病菌，具备较强的致病力。人工回接感染后染病症状与自然状态相似。经16S rRNA 测序及构建Neighnor-joining 系统发育树、生化鉴定等方法，将WY-8、WY-1、LY-2 三株病原菌鉴定为溶血葡萄球菌（MH930438）、腐生葡萄球菌（MH930439）和表皮葡萄球菌（MH930441）。Alonso等［15］研究表明，葡萄球菌具有高发病率和死亡率，是威胁很多水产养殖生物的致病菌。Sugita等［16］首次从鱼类中分离出葡萄球菌，此后有学者分别从笼养罗非鱼和珊瑚病灶组织中分离得到葡萄球菌［17，18］。国内研究报道，在草鱼［19］、南美白对虾［20］、血鹦鹉鱼［21］等也发现了葡萄球菌。研究人员用鱼源葡萄球菌感染的斑马鱼和金鱼主要病症是鳃充血出血、内脏出血、肠溃烂、游泳异常等［19，22］。患病血鹦鹉鱼主要病症为不游动，腹腔少量积液，肝脏发白，腮部发白［21］。

从生长特性分析结果和药敏试验来看，3 株病原葡萄球菌在高温33 ℃、pH 6.0、低盐（盐度3‰和19‰）的条件下更适宜生长，3 株致病菌不具备海洋细菌常见的噬盐性［23-25］。海洋水产中常用的抗生素四环素和土霉素对3 株病原葡萄球菌均有一定的抑制作用。葡萄球菌感染多见于人类临床医学，国内外已有研究中未见葡萄球菌引发仿刺参腐皮病的报道，本研究首次报道葡萄球菌可感染人工养殖的仿刺参。

本研究中病原葡萄球菌可能来自人工运输途中［26］、人工添加的饵料当中［27］或是因为抗生素的过度使用破坏正常菌群从而导致机会性葡萄球菌的感染［17］。因此，对仿刺参腐皮病的防治可适当减少抗生素的使用，更多关注益生菌［27，28］或者免疫活性物质［29］的应用。3 株新型葡萄球菌属仿刺参腐皮病病原菌的分类鉴定及特性分析，可以为腐皮病发病机制的深入研究提供一定的理论支持，以期为养殖仿刺参腐皮病的防治提供新思路。