陈艾提取物的总黄酮、总酚酸含量及抗氧化活性研究

王倩，杨利博，崔美香，王乃泽，赵敏，武玉翠

（1.河北工程大学园林与生态工程学院，河北 邯郸 056038；2.河北交通职业技术学院，石家庄 050035）

艾草（Artemisia argyiLevl.et Van）是菊科蒿属草本植物，因其全草入药，具有温经止痛、祛风散寒、抑菌抗虫和抗氧化等功效［1］，临床上常用于妇科、消化系统、皮肤类等病症的治疗。艾草的主要活性成分包括挥发油、多糖类化合物、黄酮类化合物、酚酸类化合物等，有非常重要的药用价值［2］。现代研究表明，艾草有抗氧化、抗肿瘤、抑菌等多种药理活性，这主要归功于艾叶中挥发油、酚酸以及黄酮类成分的共同作用，从中将有效成分提取出来是实现其药用价值的关键环节［3，4］。陈艾需要时间的沉淀，经过四季交替才能完成，时间越长，艾的味道越醇厚，疏通经脉的效果也会越好，所以才有“七年之病，求三年之艾”的说法。

目前，关于艾草的成分研究主要针对其挥发油以及多糖的测定，本研究以不同年份陈艾及其脱绒后陈艾残渣为原料，用超声辅助提取总黄酮、总酚酸，探究不同年份陈艾及其艾渣中含量变化趋势，考察与其抗氧化活性的相关性，从科学的角度对艾草的使用价值提供理论基础，进一步为艾草的高效利用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

YB-1000A 型多功能药物粉碎机，永康市速锋工贸有限公司；Adventurer AX 系列万分之一电子天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司；KQ-100DE 型数控超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司；HH-S 型恒温水温箱，天津赛得利实验分析仪器制造厂；ST8 ST8R 型热电高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司；TU-1810 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 材料与试剂

材料：产自河北邯郸新鲜艾草、储存一年陈艾、储存三年陈艾及脱绒后的艾渣。分别粉碎后过60目筛，粉末装密封袋置于阴凉干燥处储存备用。

试剂：芦丁对照品、没食子酸对照品、2，2-联苯基-1-苦基肼 基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-联氨-双二胺盐［2，2′-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）di-ammonium salt，ABTS］、奎诺二甲基丙烯酸酯（水溶性维生素E，6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，Trolox）均购于美国Sigma 公司；无水乙醇、Folin-Ciocalteu 试剂、甲醇、5% NaNO2、10% Al-Cl3、4%NaOH、Na2CO3、K2S2O8。

1.3 试验方法

1.3.1 总黄酮的提取与测定

1）总黄酮的提取。将干燥的待测样品放入粉碎机打磨成粉末状，过筛后装入瓶中备用。称取样品粉末20 mg，加入乙醇溶液进行提取，超声完毕后，5 000 r/min离心3 min，将上清液移至另一离心管；残渣复提1次，2次上清液合并为样品提取液。

2）标准曲线的绘制。以芦丁为标准品，精密称取10.0 mg 用60%乙醇配制浓度为1.0 mg/mL 的标准芦丁对照液；依次稀释成浓度为0.50、0.40、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01 mg/mL 的溶液，并各取500 μL 于10 mL 离心管中；依次加入4 mL 60%乙醇、100 μL 5% NaNO2溶液，充分混匀并室温静置6 min；再加入100 μL 10% AlCl3溶液，充分混匀并静置6 min 逐渐变色；最后加入300 μL 4% NaOH 溶液，摇匀，室温显色反应10 min；以60%乙醇为空白校正，采用紫外可见分光光度法于波长510 nm 处测定吸光度，试验重复3 次。以平均吸光度为纵坐标，芦丁浓度（mg/mL）为横坐标计算得出线性回归方程y=1.029 5x-0.001 8，r2=0.999 9。

3）精密度试验。从0.2 mg/mL 芦丁溶液中吸取500 μL，取6份，测定其吸光度，结果相对标准偏差（RSD）为1.03%，表明该方法精密度良好。

4）重复性试验。精密称取6 份待测样品，完成样品溶液制备，测定并计算样品中总黄酮含量，为（189.55±1.14）mg/g，RSD为0.6%。

5）稳定性试验。取待测样品分别于0、1、2、3、4 h 进行测定。结果显示，样品中总黄酮的平均质量分数为（190.23±1.09）mg/g，RSD为0.57%，表明其溶液在4 h 内稳定。

1.3.2 总酚酸的提取与测定

1）总酚酸的提取。称取一定重量待测样品粉末，加入适量乙醇溶液进行超声提取，5 000 r/min 离心3 min，将上清液移至另一离心管；残渣复提1次，2 次上清液合并为样品提取液。

2）标准曲线的绘制。将没食子酸作为标准品，精密称取10.0 mg，用去离子水制成终浓度为1.0 mg/mL的没食子酸对照品母液；再依次用去离子水稀释至浓度分别为5、10、20、30、40、50、100 μg/mL 的梯度溶液；取稀释后各梯度溶液200 μL 于10 mL 离心管内，分别加入200 μL Folin-Ciocalteu 试剂，室温暗反应8 min；最后加入600 μL Na2CO3（7.5%，W/V）、4 mL去离子水，充分混匀后，40 ℃水浴30 min。以去离子水为空白校正，于波长765 nm 处测定吸光度，试验重复3 次。以平均吸光度为纵坐标，没食子酸浓度（mg/mL）为横坐标计算得出线性回归方程y=4.956 8x+0.014 3，r2=0.999 2。

3）精密度试验。从1.0 mg/mL 没食子酸对照品母液中精确吸取200 μL，取6份，测定吸光度，结果相对标准偏差（RSD）为0.98%，表明该方法精密度良好。

4）重复性试验。精密称取待测样品6份，完成样品溶液制备，测定并计算样品中总酚酸含量，为（45.98±0.76）mg/g，RSD为1.66%。

5）稳定性试验。取待测样品分别于0、1、2、3、4 h 测定。结果显示，样品中总酚酸的平均质量分数为（39.39±1.16）mg/g，RSD为2.93%，表明其溶液在4 h 内稳定。

1.3.3 总黄酮抗氧化活性试验

1）清除DPPH 自由基能力的测定。精密称取1 mg DPPH，使用甲醇将其完全溶解后定容至100 mL的容量瓶内，得到浓度为0.001%的DPPH 反应溶液，避光储存。以提取液中所含材料的质量浓度为单位，分别将样品提取液稀释成浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mg/mL，各取不同浓度梯度的样品溶液200 μL，依次加入1.2 mL 的DPPH 反应溶液，摇晃均匀后，室温避光静置30 min，于波长517 nm 处测定反应液吸光度（A样品），同时将甲醇反应液的吸光度作为空白（A空白），试验重复3 次取平均值。依照DPPH 自由基清除率公式，计算出不同浓度下样品DPPH 自由基清除率，以样品浓度为横坐标，DPPH 清除率为纵坐标绘制标准曲线。通过GraphPad Prism 软件计算出不同浓度下样品自由基清除能力的IC50值。DPPH自由基清除率公式如下：

2）ABTS+自由基清除能力测定。精密称取384.076 mg ABTS，用去离子水定容至100 mL 容量瓶中，配制成浓度为7 mmol/L 的ABTS 溶液。称取66.284 mg K2S2O8，用去离子水定容至100 mL 容量瓶内，配制成浓度为2.45 mmol/L 的K2S2O8水溶液。将上述2 种溶液各取10 mL 混合均匀，室温避光条件下放置12～16 h，得到ABTS+工作液母液。用适量的无水乙醇将其稀释至波长734 nm 处吸光度为0.7±0.02 的溶液，制成ABTS+工作液。以水溶性维生素E（Trolox）作为标准品，使用无水乙醇稀释成浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24 mg/mL的标准品溶液。再分别取0.1 mL 上述各浓度溶液，依次加入4 mL ABTS+工作液，室温避光反应6 min后，于734 nm 处测定吸光度（A样品），同时将去离子水反应液的吸光度作为空白（A空白）。依照ABTS+自由基清除率公式，计算ABTS+自由基清除率，以样品浓度为横坐标，ABTS+自由基清除率为纵坐标绘制标准曲线。将待测样品提取液适当稀释后，按照上述方法进行测定，计算出ABTS+自由基清除率，带入相对于水溶性维生素E（Trolox）含量公式Y=377.96X+8.429 4，得出与单位干材料样品同等ABTS+自由基清除能力的Trolox 等同物质含量，以Trolox 抗氧化活性当量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）为单位。ABTS+自由基清除率公式如下：

2 结果与分析

2.1 样品中总黄酮含量

由图1 可知，不同放置时间下艾草及艾渣总黄酮含量差异明显。总黄酮含量为三年陈艾＞一年陈艾＞三年陈艾艾渣＞新鲜艾草。三年陈艾提取黄酮效果最好，为191.33 mg/g，约是脱绒后艾渣总黄酮含量的2.95倍，一年陈艾总黄酮含量的2倍，新鲜艾草总黄酮含量的5.93 倍。可见脱绒后艾渣仍含有黄酮类物质，并且有一定的利用价值。

图1 不同年份陈艾及艾渣中总黄酮含量

2.2 样品中总酚酸含量

由图2 可知，新鲜艾草、一年陈艾、三年陈艾及脱绒后艾渣的总酚酸含量有显著差异，分别为5.52、30.40、43.45、19.88 mg/g。总酚酸含量高低依次为三年陈艾＞一年陈艾＞三年陈艾艾渣＞新鲜艾草，说明三年陈艾使用价值最高，其脱绒后艾渣也为今后提供了重要的研究价值。

图2 不同年份陈艾及艾渣中总酚酸含量

2.3 样品提取物清除DPPH 自由基能力

不同年份陈艾及脱绒后艾渣提取物在不同样品浓度条件下清除DPPH 自由基能力如图3 所示。在相同浓度范围内，不同年份的提取物对DPPH 自由基的清除作用存在差异。当样品浓度在0.05～0.20 mg/mL时，各样品提取物对DPPH 自由基的清除能力增长较快。其中，三年陈艾提取物对DPPH 自由基清除率从25.89%增加到94.15%；而新鲜艾草提取物对DPPH 自由基清除率增长较为缓慢，由4.85%增加到17.15%。当样品浓度在0.25～0.35 mg/mL时，一年陈艾提取物对DPPH 自由基的清除率约达94.51%，三年陈艾提取物高达96.81%。新鲜艾草、一年陈艾、三年陈艾及脱绒后艾渣的IC50 值分别为0.69、0.13、0.09、0.41 mg/mL。三年陈艾提取物IC50值最低，可见三年陈艾提取物对DPPH 自由基有较强的清除作用。

图3 不同浓度下陈艾及艾渣提取物DPPH 自由基清除活性比较

2.4 样品提取物清除ABTS+自由基能力

不同年份陈艾及脱绒后艾渣提取物在不同浓度条件下清除ABTS+自由基能力如图4 所示。各样品对ABTS+自由基的清除率分别为新鲜艾草23.53%、一年陈艾53.24%、三年陈艾53.84%、三年脱绒后艾渣27.39%。对ABTS+自由基的清除能力依次为三年陈艾＞一年陈艾＞三年陈艾艾渣＞新鲜艾草，说明三年陈艾对ABTS+自由基的清除能力与一年陈艾相当，有较强的清除作用。将所得清除率带入相对于水溶性维生素E（Trolox）含量公式，由图5 可知，一年与三年陈艾水溶性维生素E（Trolox）含量无显著性差异，新鲜艾草与三年陈艾艾渣也无显著差异。新鲜艾草、一年陈艾、三年陈艾及脱绒后艾渣对ABTS+自由基清除能力相对于水溶性维生素E（Trolox）含量分别为7.99、23.71、24.03、10.03 mg/g，说明三年陈艾提取物不但对ABTS+自由基有较好的清除作用，而且相对于水溶性维生素E（Trolox）含量也是最高的，反之新鲜艾草含量相对较低。

图4 不同年份陈艾及艾渣提取物对ABTS+自由基清除活性比较

图5 不同年份陈艾及艾渣ABTS+自由基清除能力相对于Trolox 含量比较

2.5 陈艾总黄酮、总酚酸含量与其抗氧化活性的相关性分析

各样品提取物的总黄酮、总酚酸含量与其抗氧化活性的相关性（图6）显示，陈艾总黄酮、总酚酸含量与其DPPH 自由基清除能力相关系数分别为0.698 3（P＞0.05）、0.871 6（P＞0.05），与ABTS+自由基清除能力相关系数分别为0.680 0（P＞0.1）、0.816 0（P＞0.05），因为P＞0.05，所以相关系数无意义，说明陈艾总黄酮、总酚酸含量与其抗氧化活性无显著相关性。

图6 陈艾总黄酮、总酚酸含量与其抗氧化活性的相关性比较

3 小结与讨论

黄酮类化合物与酚酸类化合物是存在于自然界具有2-苯基色原酮结构的一类化合物，广泛存在于药用植物中，属于植物在长期自然过程中产生的次生代谢产物［5，6］。相关研究表示，不同年份不同产地艾草所含总黄酮、总酚酸成分也有所差异。吕雪［7］在分析艾叶中有效成分的变化规律时发现，随着艾叶生长年份的增加，其有效成分含量也随之发生变化。其中，总黄酮类成分随年份的增加而逐渐增加，达到峰值后再降低，与龚敏等［8］的观点相似，他们对一到五年的陈艾总黄酮进行了研究，认为陈艾中总黄酮含量随储存年份的延长逐年升高，但在第3 年达到峰值后开始急剧下降。薛紫鲸等［9］对6 个采收时期36 批祁艾进行了总黄酮含量的测定，结果表明，不同采收期的祁艾化学成分含量存在一定的差异性，不同采收期总黄酮含量变化规律较为一致，均以第3 个采收期的含量最高，而且黄酮类指标成分含量变化与总黄酮含量变化趋势较为相同。此外，杨观兰等［10］在研究南酸枣叶总黄酮及其抗氧化活性的过程中发现，南酸枣叶黄酮纯化后有较强的抗氧化活性，在一定浓度范围内呈依赖关系，并且认为在相同黄酮浓度范围，浓度增加其自由基清除能力越强。黄琴等［11］同样在研究时发现铁皮石斛总黄酮含量、总酚含量与抗氧化活性之间密切相关。而尚红梅等［12］研究表明，菊苣根的抗氧化活性与其总黄酮含量相关性不大，但与总酚含量明显相关。王毕妮等［13］研究发现，红枣中总黄酮、总酚含量与其抗氧化活性无显著相关性，这与本研究结果一致，陈艾总黄酮与总酚酸含量和采用DPPH、ABTS+法评价的抗氧化性无显著相关，说明黄酮类物质结构中的复杂性是影响结果差异的重要因素之一。

本研究采取了简单易行的超声辅助提取法对陈艾中的黄酮类及酚类物质进行了提取，并且对其抗氧化活性有了初步的研究。结果表明，新鲜艾草、一年陈艾、三年陈艾及脱绒后艾渣的总黄酮、总酚酸含量存在差异。总黄酮及总酚酸含量会随储存年份的增加而逐渐增加，其抗氧化活性会因浓度的增加而随之增强。不同年份陈艾提取物抗氧化活性存在较大差异。最终得出储存三年陈艾总黄酮、总酚酸含量较高，同样对DPPH 自由基、ABTS+自由基有较强的清除能力，而新鲜艾草所含黄酮类、酚类物质较少，对自由基的清除率也相对较低。据相关性研究显示，陈艾总黄酮、总酚酸含量与其DPPH 自由基清除能力相关系数分别为0.698 3（P＞0.05）、0.871 6（P＞0.05），与ABTS+自由基清除能力相关系数分别为0.680 0（P＞0.1）、0.816 0（P＞0.05），因为P＞0.05，所以相关系数无意义，说明陈艾总黄酮、总酚酸含量与其抗氧化活性无显著相关性。此外，在本研究中发现脱绒后的艾渣中含有黄酮类及酚类物质，虽然含量相对陈艾有所降低，但仍有利用价值。通过提取艾绒以及副产品的深加工，使得艾草的附加值不断增加，生产过程中所产生的艾渣在养殖场则是不可或缺的宝贝。饲养户利用艾渣和一些玉米、谷糠搅拌喂鸡喂兔，饲养长大的鸡和兔抗病力有所提高，死亡率也大幅度下降。刘洪丽等［14］研究表明在饲粮中添加艾叶粉可以提高畜禽饲粮粗脂肪的消化率，促进畜禽生长发育。后期可以研究如何高效发酵艾渣作为饲料，提高其综合利用价值。本研究为艾草的陈化期提供了理论依据和数据支撑，还为艾渣的开发利用提供了参考方向［15］。